Isaac M Ogara, Michael Sulyok, Anthony Negedu, Kolawole I Ayeni,Zega M Zebedee, John D Mamman, Abiodun Adedokun, Janet I Ogara,Eunice A Adgidzi, Chibundu N Ezekiel,✉, Rudolf Krska,

（1. 纳萨拉瓦州立大学，沙布拉菲亚校区，农学院农学系PMB 335，尼日利亚 纳萨拉瓦州凯菲，950101；2. 维也纳自然资源与生命科学大学（BOKU），生物分析与农业代谢组学研究所，农业生物技术学院（IFA-Tulln），奥地利 图尔恩，20. 3430；3. 原材料研究与发展委员会，尼日利亚 阿布贾迈塔马，904101；4. 巴布科克大学 微生物系，尼日利亚 奥贡州伊利山雷莫，121103；5. 纳萨拉瓦州立大学 农业学院 基础科学系化学组PMB 335, 尼日利亚纳萨拉瓦州拉菲亚，950101；6. 纳萨拉瓦州立大学 农业学院 家庭科学系，沙布拉菲亚校区PMB 335，尼日利亚 纳萨拉瓦州拉菲亚，950101）

联合国粮农组织指出，全球平均膳食能量摄入量从2005年每天的2 753 kcal/cap，增加到了2016 年每天的 2 904 kcal/cap[1]，表明全球食物供应量有了显著的增加。尽管食物供应量剧增，但撒哈拉以南非洲（SSA）仍有相当一部分人营养不良，其基本因素虽然复杂，但食物作物受到真菌毒素污染和贫困因素归为其中[2-3]。尽管这些因素并不局限于某一特定区域，但真菌毒素威胁造成的负担在诸如尼日利亚等的SSA国家中还是非常高的，这些地区采收前后的作物栽培和管理的措施非常不完善，并且气候条件助长了食品受真菌毒素污染的频率[4-11]。每天连续摄入真菌毒素，依据污染食物摄取量，会对人体产生一系列有害影响。这些影响范围从急性（如恶心、呕吐）到慢性（如癌症），甚至死亡[2,12]。

在尼日利亚，灌木芒果(拉丁学名Irvingia gabonensis，在当地称为dikanut或 ogbono)、腰果(Anacardium occidentaleL.)、秋葵(Abelmoschusesculentus(L.) Moench)、高粱(Sorghum bicolorL.)和芝麻(Sesamum indicumL.)食物等作物是大多数家庭消费的主食，可在不同的市场买到。分自芒果果实的大部分干燥种子（a drupe）和新鲜秋葵的全果（制成的一种胶囊）或者干燥碾成粉可分别做成浓稠的ogbono和okro汤[9,13-15]。高粱是一种谷物，而芝麻是一种小油籽，二者在尼日利亚的不同地区都有广泛种植。在尼日利亚，高粱主要被加工成传统的食物，如masa，ogi，tuwo和waina[4,16]，而芝麻通常首选作食用油，也可作为食物的香料[16-18]。高粱和芝麻也可作为传统加工饮料（如kunu）的原料[19-20]。烤腰果通常作为即食小吃食用。总之，这些食物作物是尼日利亚家庭膳食中十分主要的摄入成分，尤其在纳萨拉瓦州所属的北部地区。因此，为了保障消费者的健康，有必要对食品的真菌毒理学安全性进行评估。

此前的研究报道了尼日利亚不同地区高粱和芝麻[4,16,18,21]、灌木芒果[9]和腰果[22]的真菌毒素污染情况。然而，关于纳萨拉瓦州市售的这类食品真菌毒素情况的数据很少。此外，在来自纳萨拉瓦州的玉米[6,23]、即食家庭食品[24]和人类尿液[25]中，测量到了很高含量的真菌毒素混合物。因此，纳萨拉瓦州可能成为真菌毒素中毒的热点地区，因此，有必要评估该州不同食物来源受真菌毒素的影响。此外，监测公共市场出售的食品和通常作为主食消费的食物作物是否受到真菌毒素污染是十分重要的，这样有利于提供数据，进而为可行的干预措施提供信息。因此，本研究旨在阐明在纳萨拉瓦州市售的灌木芒果、腰果、干秋葵、高粱和芝麻的真菌毒素污染情况。

1 材料与方法

1.1 样品采集

从尼日利亚纳萨拉瓦州的主要市场购买了107份食物作物，其中灌木芒果（n=12）、烤腰果（n=12）、干秋葵（n=12）、芝麻（n=35）和高粱（n=36）。在该州的三个农业区（南部地区（拉菲亚地区）、北部地区（阿克旺加地区）和西部地区（凯菲地区）选择了具代表性的主要市场。在每个市场中，随机选择食物作物供应商；每五家供应商中选中一家。从每个随机选择的供应商中采集一份食物作物样本。芝麻和高粱样本每份重1 kg，每份依取自储藏箱不同部分形成3～4份子样品，而其他食物样本重约300 g，包括4个随机选择的预包装食品子样品。采集的食品样本在供应商商店储存不超过14 d。所有食品样品立即研磨成粉并储存在-20 ℃至分析用，多种真菌毒素的分析在奥地利生物分析和农业代谢组学研究所（IFA-Tulln）进行。

1.2 样品的多种真菌毒素分析

采用 Sulyok等[26]报道的 LC-MS/MS方法来定量分析食物样品中包括真菌毒素在内的500多种微生物代谢物。

1.2.1 化学药品

甲醇（色谱级）和冰醋酸（分析级）：默克公司（德国达姆施塔特）；乙腈（色谱级）：VWR公司（比利时鲁汶）；醋酸铵（质谱级）：西格玛奥德里奇公司（奥地利维也纳）；真菌毒素标准品根据Abia等的研究报道[27]，真菌毒素标准品：其他研究组提供或购自商业公司；实验用水：Elga Purelab超分析系统反渗透连续净化制备，威立雅公司（英国巴克斯）。

1.2.2 仪器与设备

50 mL聚丙烯试管：德国纽布瑞赫特，莎斯特；GFL 3017振荡培养箱（旋转摇床）：德国布格韦德尔；QTrap 5500 LCMS/MS系统：美国加州福斯特，应用生物系统公司；电喷雾电离源（ESI）源、1290系列 HPLC系统：德国瓦尔特布隆，安捷伦公司；色谱柱、保护柱：美国加利福尼亚州托伦斯，飞诺美公司。

1.2.3 代谢物的提取和回收率的测定

每个样品取5 g，置于50 mL聚丙烯试管中，用20 mL萃取剂（乙腈∶水∶醋酸=79∶20∶1，v/v/v）萃取代谢物。测定回收率时，每个样品取0.25 g加入100 μL多标物母液，放置一夜，以建立样品和加标物之间的平衡，随后用1 mL（乙腈∶水∶乙酸 = 79∶20∶1，v/v/v）均一化。上述样品用GFL 3017振荡培养箱（旋转摇床）振荡提取90 min，提取液用稀释溶剂（乙腈∶水∶醋酸=20∶79∶1，v/v/v）稀释为 1∶1（v/v），并在LC-MS/MS仪器上样并分析[28]。

1.2.4 LC-MS/MS 参数

微生物代谢物的 LC-MS/MS筛选测定采用QTrap 5500 LCMS/MS系统，配备电喷雾电离源（ESI）源和 1290系列 HPLC系统。色谱柱为Phenomenex Gemini C18（150 mm×4.60 mm，5 μm），保护柱为 Phenomenex C18（4 mm×3 mm，5 μm），温度 25 ℃，色谱方法、色谱和质谱参数按照Sulyok等的报道[26]。ESI-MS/MS在多反应监测（MRM）模式下，每个样品两次色谱运行中对每种分析物进行两次裂解反应扫描。各分析物的MRM 检测窗口分别设置为正离子和负离子模式下其保留时间±20 和±26 s。

鉴定通过获得每种分析物两个 MRMs（串珠镰刀菌素除外，其仅显示一个碎片离子）进行确认。根据欧洲委员会2002/657号决议会产生的4个识别点值。此外，两个MRM跃迁的LC保留时间和强度比分别在 0.1 min和30%内与真实标准相关值一致。

1.2.5 真菌毒素的定量

基于线性、1/x称重校准，使用外标定量，多组分母液梯度稀释。对回收率的浓度进行了校正。该方法的准确性通过多实验室间比较研究得到验证[26,30]，包括BIPEA组织的常规方案（法国热讷维耶）。检出限和定量限根据欧拉赫姆指南在低浓度水平上加标样品的标准差确定。

1.3 数据分析

SPSS 17.0 Windows版本用于分析真菌毒素数据。采用简单的描述性统计用于分析食品中真菌毒素/代谢物分布的相关数据。食物作物中的真菌毒素浓度使用方程 y=Log10（1+真菌毒素含量µg/kg）进行转换，创建用于比较毒素水平的正态分布。所有分析的误差水平均设置为5%。

2 结果与分析

2.1 LC-MS/MS方法的测定结果与微生物代谢物概况

表1列出了来自纳萨拉瓦州食物作物的80种真菌和细菌代谢物的LC-MS/MS方法测定结果。灌木芒果、腰果、干秋葵、芝麻和高粱等的代谢物回收率范围分别为 38.9～167、23.9～602、9.3～243、9.2～225和61.0～140。大量偏离100%回收率的情况主要归因于基质效应，而萃取步骤的回收率被发现符合大多数分析物的性能标准(例如70%～120%)[26]。检测限范围为0.008～240 µg/kg。总体而言，在107份食品样本中检出的所有真菌毒素中，脱氧雪腐镰刀菌烯醇是最常见的真菌毒素（发生率：65%；范围：8.7～256 µg/kg；平均值：63.6 µg/kg），而伏马毒素的污染水平最高（发生率：22%；范围：3.7～2 938 µg/kg；平均值：477 µg/kg（图1）。

表1 尼日利亚纳萨拉瓦州市售的常见食物作物中代谢物的方法测定结果Table 1 Method performance characteristics for metabolites in commonly consumed food crops marketed in Nasarawa state, Nigeria

续表1

图1 尼日利亚纳萨拉瓦州销售的107份常见食物作物样本中的真菌毒素水平Fig.1 Mycotoxin levels in 107 commonly consumed food crop samples marketed in Nasarawa state, Nigeria

2.2 高粱和芝麻中的真菌毒素

高粱和芝麻中真菌毒素和其他真菌代谢产物的含量数据见表2。在高粱样品中，共检测到14种真菌毒素，包括黄曲霉毒素 B1（AFB1）、伏马毒素（FB1）、脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）、赭曲霉毒素A（OTA）和玉米赤霉烯酮（ZEN）；而在芝麻样品中，检测到8种真菌毒素（包括DON，FB1和 ZEN），在所有芝麻样品中，均未检测到AFB1和OTA。我们在高粱样品中的AFB1、OTA和ZEN研究结果与尼日利亚、埃塞俄比亚和突尼斯之前的报道一致，这些国家在高粱中也发现了类似的真菌毒素[4,32-34]。黄曲霉毒素 B1污染了19%的高粱样品（最大：4.75 µg/kg；平均值：2.04 µg/kg）。这低于 Makun 等[4]和 lahouar等[33]来自尼日利亚和突尼斯流行率的报告水平，分别是 54%（最大值：1 164 µg/kg；平均值：199.5 µg/kg）和59.4%（最大值：31.7 µg/kg）。造成这差异的显著原因，可能与高粱样品的质量和数量有关。Makun等[4]分析了 168份明显发霉的高粱，这可能导致了具有更高的流行率；而 Lahouar等[33]则分析了另外的高粱样本（n=64）。然而，我们的结果却高于Chala等报告的埃塞俄比亚的70份的高粱结果，其结果为12.9% (最大值：62.5 g/kg；平均值：29.5 g/kg)。我们在芝麻样品中未检测到AFB1的结果与尼日利亚之前的报告一致，在高原地区的 17种芝麻中均未发现黄曲霉毒素[18]。然而，却与伊朗和埃及已报道的形成了对比，伊朗和埃及报告芝麻样品中 AFB1含量分别为 18.1%（平均值：1.62 µg/kg）并且60%以上的芝麻样含该毒素（平均值：66.74 µg/kg）[35-36]。

表2 尼日利亚纳萨拉瓦州市售的芝麻和高粱中真菌毒素和其他微生物代谢产物的检测Table 2 Occurrence of mycotoxins and other microbial metabolites in sesame and sorghum marketed in Nasarawa state, Nigeria

高粱和芝麻中检出了伏马毒素，包括伏马毒素 B1、B2、B3和B4。伏马毒素B1污染了较多的高粱样品（发病率：47%；最大值：2 105 µg/kg；平均值：461 µg/kg）、较少的芝麻样品（发病率：9%；最大：15.4 µg/kg；平均值：12.5 µg/kg）。本研究高粱样品中检测到的伏马毒素含量（FB1、FB2和FB3之和）的最大值和平均值分别高达2 862 µg/kg和730 µg/kg。这些值高于之前在埃塞俄比亚高粱中报告的伏马毒素含量（FB1、FB2和FB3之和）（最大值：40.99 µg/kg；平均值：22.22 µg/kg），也高于尼日利亚的四个农业生态区（最大值：179 µg/kg；平均值：150 µg/kg）[32,37]，但低于尼日利亚尼日尔州四个小气候区20份高粱样品中的含量（最大值：8 400 µg/kg；平均值：6 198 µg/kg）[34]。然而，本研究的芝麻中 FB1+FB2的含量水平（最大值：21.7 µg/kg；平均值：18.8 µg/kg）与先前在阿布贾（尼日利亚北部）24份芝麻样本中报告的水平相似（最大值：37.9 µg/kg；平均值：25.9 µg/kg）[38]。脱氧雪腐镰刀菌烯醇是芝麻中最常见的真菌毒素（发生率：100%；最大：256 µg/kg；平均值：114 µg/kg），也是高粱中最常见的真菌毒素（发病率：97%；最大：19.5 µg/kg；平均值：13.4 µg/kg）。我们在芝麻中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇含量高于Fapohunda等[38]报告的脱氧雪腐镰刀菌烯醇数据（发病率：58%；最大：171 µg/kg；平均值：78.3 µg/kg）。本研究高粱样品有 16%污染了赭曲霉毒素A（最大：42.9 µg/kg；平均含量为16.5 µg/kg）。这污染率低于Makun 等[21]及 Onyedum等[34]分别报道的 94%（最大值：29.5 µg/kg；平均值：8.28 µg/kg）和 75%（最大值：5.60 µg/kg；平均值：2.44 µg/kg）。相反的还有我们的芝麻样品，没有一个被赭曲霉毒素A污染的，这与Makun等[21]的观察结果形成了鲜明的对比，他们报告的尼日尔州（尼日利亚北部）19份芝麻 100%被赭曲霉毒素A污染。约29%的芝麻和8%的高粱样品含有玉米赤霉烯酮：最高（平均）浓度分别为4.33（1.82）µg/kg 和 10.6（8.25）µg/kg。然而，据报道，来自尼日利亚和埃塞俄比亚的芝麻和高粱中的 ZEN污染率分别为 100%（最大值：1.25 µg/kg；平均值：0.806 µg/kg）和 32.9%（最大值：374 µg/kg；平均值：43.8 µg/kg）[32,39]。我们的这些结果与以往文献报道的有关这两种农作物的结果之间的差异可能归因于多种因素，包括各研究分析的样本量不同、在进行各项分析时分析仪器性能的差异、不同地理环境的影响、农业（采收前后）规范措施，以及污染食物作物的真菌多样性。在高粱和芝麻中定量的21种其他真菌代谢产物中，大黄素（emodin）/曲酸（kojic acid）/大孢菌素（macrosporin）和色醇（tryptophol）分别在97%和100%的样品中出现。

2.3 灌木芒果、腰果和秋葵中的真菌毒素

在灌木芒果、腰果和干秋葵中，真菌毒素和其他微生物代谢物的分布（发生率和含量）见表3。在检测到的10种真菌毒素中，灌木芒果中检测到6种（AFB1、AFG1、AFM1、交链孢酚甲醚、环丙酮酸和OTA），腰果中检测到2种（AOH和BOU），干秋葵中检测到7种（除AFG1、AFM1和AOH外）。灌丛芒果样本中的AFB1（最大值：19.2 µg/kg）和AFM1（最大值：1.41 µg/kg）的含量比先前报道的拉各斯（尼日利亚南部）市场40份灌木芒果样品中的 AFB1（713.2 µg/kg）和 AFM1（25.5 µg/kg）的最高水平分别低37倍和13倍[9]。这些差异的原因主要是采收后的储存时间和条件。本研究中的样品在供应商处存放时间不超过 14 d，而 Ezekiel等[9]分析的样品存放时间为15～90 d，其报道最大污染水平发现在储存时间越长的变色样品中。

表3 在尼日利亚纳萨拉瓦州市售的腰果、灌木芒果和干秋葵中的真菌毒素和其他微生物代谢物Table 3 Mycotoxins and other microbial metabolites in cashew nut, bush mango and dried okra marketed in Nasarawa state, Nigeria

续表3

在本研究中分析的干秋葵样品只有 3/12（25%）受到AFB1污染，其含量达到8.27 µg/kg。此前，在尼日尔州（尼日利亚北部）的20份秋葵中未检测到黄曲霉毒素[40]，而我们发现的黄曲霉毒素含量高于贝宁、马里和多哥（最大：5.4 µg/kg）[41]和土耳其（最大：1.7 µg/kg）[42]市场上报道的含量。在这里，我们还报告了一份干燥秋葵样品（3.4 μg/kg）的OTA污染情况，之前没有黄秋葵OTA污染的报告。秋葵是一种易腐的食物作物，通常是从农场新鲜收获来的；然而，为了延长其保质期，销售商将秋葵果实切成小块以晒干保质。在大多数情况下，秋葵是在裸露的土壤上干燥的，因此，秋葵暴露于土壤真菌和接触环境中产生的霉菌孢子[13]。也许，这种粗陋的加工/贩卖方式是导致分析的秋葵样品中存在多达7种真菌毒素的原因，包括了黄曲霉毒素B1。

在所有腰果样本中均未检出黄曲霉毒素，这与 Lamboni等[43]和 sombie等[44]的报道一致。他们分别在贝宁和塞拉利昂的84和50份腰果中未发现黄曲霉毒素。然而，我们的发现与 Milhome等[45]和Adetunji等[22]的报道相反，他们记录了来自巴西和尼日利亚的腰果中黄曲霉毒素分别高达31.5 µg/kg 和 6.8 ng/g。鉴于多年来报告的腰果真菌代谢物在类型和模式上存在差异，为了更好地了解污染情况，需要对不同处理条件和来自不同大陆的食品原料在实验室间进行综合研究。在灌木芒果、腰果和秋葵干样品中还检测到了其他51种真菌代谢物，且含量不同。此外，有三种细菌的代谢物被检测量化，包括在食物作物中唯一检测到的氯霉素。

2.4 食品中检测到的真菌毒素对公众健康的影响

在对公众健康影响的食品真菌毒素中，AFB1是最强的真菌毒素，被归类为I类人类致癌物[46]。它的摄入与肝癌和免疫抑制有关[2,47]。所有受污染的秋葵、两份灌木芒果和一份高粱样品中的黄曲霉毒素浓度都超过尼日利亚食品中黄曲霉毒素总量4 µg/kg的允许限值。尽管本研究调查的样本量相对较少，但由于每日进食会导致长期摄入黄曲霉毒素，因此任何食物含有黄曲霉毒素都会对公众健康构成潜在风险。此外，样品中 AFB1与其他可能致癌和具肾毒性真菌毒素（如 FB1和OTA）以及其他新出现的真菌毒素（如BEU）同时出现，值得引起关注，因为该地区广泛食用这些食物作物[2,46,48]。在至少19%的高粱样品中（尽管 FB1浓度较低），AFB1与 FB1共存；而在灌木芒果和干秋葵样品中，AFB1与 OTA共存的比例分别超过 17%和 8%。这两种真菌毒素已被报道可相互作用，加剧了对人类特别是儿童健康的不良影响[49]；然而，现研究报告的浓度的作用尚不清楚。近来从体外联合毒理学研究中获得的知识表明，几种真菌毒素组合具有潜在的添加和/或协同效应[50-51]，因此可能需要进一步研究探讨报告的各种毒素的作用效应。

3 讨论与结论

本研究表明，在尼日利亚纳萨拉瓦州当地市场上出售的主要食物作物灌木芒果、腰果、干秋葵、芝麻和高粱很容易受到真菌毒素污染。由于高粱含有14种真菌毒素，因此是最容易受影响的粮食作物。此外，本研究发现了之前未报道的干秋葵中有赭曲霉毒素A，且与黄曲霉毒素B1存在共存情况。本文提供的数据为可行的干预措施提出提供了相关参考，例如：1）在家庭层面上在高架平台上烘干这些食品，以防止接触裸露的土壤；2）秋葵和灌木芒果晒干后粉碎，适当包装在气密塑料容器或玻璃纸袋中，并在低温（<10 ℃）下储存，以防止真菌毒素的产生。此外，政府应通过相关机构在社区一级提供机械干燥机，以便于干燥各种农产品，从而最大限度地减少真菌生长。