王洪预 刘佳欣 宋慧宁 陈浩源 赵占名 赵磊 刘宏魁 李秋祝

(吉林大学植物科学学院，吉林 长春 130062)

遗传学是当今生命科学中发展最快、最活跃的学科之一，是生物学科各专业的重要基础课[1]。温带生物黑腹果蝇(Drosophila melanogaster，2n=8)作为遗传学研究中的模式生物，在遗传、发育、衰老、肿瘤、神经退行性疾病等领域的研究中具有重要地位。以果蝇为材料的遗传学实验，可覆盖分离规律、自由组合规律和独立分配规律，是中学及高校本科生物学实验教学中重要的实验对象[2]。“孟德尔的豌豆杂交实验”是人教版生物学教材必修内容[3]，也是高校遗传学实验教学的重点和难点。用豌豆作为材料进行实验受制于实验条件和时间，学生无法亲手操作完成。因此，在遗传学3大规律的验证性实验中，果蝇一直都是首选实验材料[4]。果蝇作为经典的遗传学实验材料有其突出优点，主要表现在5个方面，生长迅速，世代周期短；繁殖力强，后代数量大，便于统计分析；个体小，饲养管理方便；变异类型多，易于观察和杂交组合；有巨大型染色体，且数目较少(2n=8)，便于观察研究[5]。对果蝇进行性状观察和性别鉴定是果蝇实验重要内容，也是进行遗传规律实验前必须熟练掌握的技能。初学者往往因实验经验不足，果蝇处于麻醉状态时间短，很难在有限的时间内完成操作，及时挑选出所需的处女蝇。一旦出现观察未完成但果蝇已经苏醒的情况，不得不进行反复麻醉，很容易造成果蝇死亡。此外，乙醚已被列为国家二级易制毒管控试剂[6]，具有挥发性且易燃易爆，同时对实验操作者身体也可能会造成一定的伤害。果蝇的低温与CO2麻醉技术均安全可靠，效果也较好，但对实验设备及条件要求较高，很多装置都是各教学科研单位自制，没有批量生产，不能在市场上直接购得[7]。

制作果蝇永久制片，可以使学生有充分时间详细观察果蝇的性状，并准确进行性别鉴定，对于初学者而言，是简单有效的解决办法。果蝇性别鉴定与性状观察需要确认多个部位细节，所以制片应尽可能地保持果蝇生活姿态，不破坏其身体结构。本团队根据教学实际需要，摸索总结出一套操作简单的果蝇永久制片制作方法，且无需增加实验室投入。所得制片可以在4℃冰箱中长期保存，在室温下正常反复使用，目前已经在相关实验教学中得到了成功应用。

1 果蝇永久制片的制作

1.1 实验备品

解剖针、镊子、培养皿、胶头滴管、接种针(或小毛笔)、小药匙、载玻片、盖玻片、麻醉瓶、白纸板、标签纸、体视显微镜，如图1。

图1 实验备品

1.2 实验试剂

乙醚、70%乙醇、95%乙醇、无水乙醇、二甲苯、树胶、蒸馏水，如图2。

图2 实验试剂

1.3 制作步骤

1.3.1 选材

选取符合性状要求的果蝇，乙醚麻醉后置于载玻片。以活体果蝇乙醚麻醉后直接进行制片为最佳；实验过程中淘汰的果蝇，麻醉后迅速放入70%乙醇中，在15d内用来制片效果也较好；死去时间过长的果蝇因身体卷曲或失水，不宜用于制片。

图3 死后30d制片 图4 死后15d制片 图5 麻醉后立即制片

1.3.2 清洗

将果蝇放于载玻片上，加入1滴纯净水，洗去体表的螨虫、粘着的培养基和灰尘等，要小心操作，注意不要损伤果蝇的翅及身体。清洗和移动果蝇时，可用小药匙配合接种针进行操作，须单只进行。接触液体后，不能再用小毛笔移动果蝇。

1.3.3 透明

将清洗后的果蝇移入盛有二甲苯培养皿中，透明约5min。此过程可增加标本对比度，观察时效果更佳。

1.3.4 脱水

将透明后的果蝇分别放入盛有浓度为70%、95%、100%乙醇的培养皿中，各浸泡3min，以脱去果蝇表面水分，确保果蝇标本不会因后期脱水而导致变形，影响观察效果。

1.3.5 整姿

用解剖针在洁净载玻片上滴1小滴树胶，树胶量不宜过多，多余树胶在盖片外会影响制片的美观，可用二甲苯去除。将脱水后的果蝇放入树胶中，利用接种针等工具将果蝇调整到理想观察姿态。按观察目的不同，可将翅、复眼和前足等部位调整至最佳角度，如性状观察主要区分长翅与小翅、红眼与白眼以及体色的不同；性别鉴定主要观察性梳的有无、腹部条纹数和外生殖器等。此过程中，如树胶出现起皱现象，可用解剖针沾取少量二甲苯于树胶上，以保证操作顺利进行。

图6 白眼小翅雄蝇 图7 红眼小翅雄蝇 图8 红眼长翅雌蝇

1.3.6 盖片

整姿完成后，迅速用镊子小心盖上盖玻片，再利用解剖针轻轻按压，使树胶在盖片下均匀分布，并排出气泡，盖片不能用力按压，否则会导致果蝇身体破裂。盖片四周如有空隙，可再补充少许树胶封好。盖玻片可稍大一些，这样能够容纳较多树胶，使果蝇在长时间封存中不产生变形或氧化。根据经验，使用14mm圆形盖玻片即可达到较好效果。

1.3.7 标注

标注应写明果蝇性状和性别，注明制作日期和制作人。因果蝇体型较小，所以全部操作过程均需在体视显微镜下进行，但放大倍数不宜过高，体视显微镜(厦门Motic)放大20倍即可满足要求。放大倍数过高，难以精确控制果蝇位置，会影响实验效果。

图9 学生完成的制片 图10 实验室现有制片

2 果蝇永久制片在教学中的应用

实验室所用果蝇品系，最佳保存条件为18℃，60%湿度，每28d左右需更换1次培养基[8]。一般在教学使用前30d，需进行扩繁，并于25℃条件下保存，供学生观察与实验操作。果蝇永久制片的开发，使以下实验不受时间和条件限制，学生随时可以开展实验。

2.1 果蝇形态与性状观察

果蝇形态与性状观察一直是使用果蝇第一课。野生型果蝇为红眼、长翅、直刚毛、灰身，对应各种突变型分别为白眼、小翅、卷刚毛、黑檀体等。对果蝇各种形态特征的观察是认识并利用果蝇第一步。但无论采用低温麻醉还是乙醚麻醉，果蝇都会在较短时间内恢复行动能力，要求观察者快速准确完成操作[9]。学生做为初学者，往往不能在有限时间内掌握实验要求内容。果蝇永久制片在4℃冰箱内可长期保存，反复使用，而且对观察者无技术上要求，可以随时进行观察，学生有充分时间准确区分各种性状，无需担心果蝇苏醒而中断观察。

2.2 果蝇的性别鉴定

以果蝇为实验材料的遗传规律验证实验，如自由组合规律实验和伴性遗传实验，都需要准确选用处女蝇，这是实验成败的关键。刚羽化的果蝇体色较浅，身体未完成展开，因此采用观察腹部条纹和根据体型大小的差别进行鉴定并不可靠。在处女蝇的选取中，分辨雌雄果蝇最准确方法就是观察性梳的有无[10]，而初学者在有限时间内很难准确判断性梳的有无，从而导致挑选处女蝇失误，造成实验失败。利用果蝇永久制片，可对性梳的位置、形态有准确的认知，并结合体型、腹部末端条纹等形态特征对果蝇的性别做出判断，这样在处女蝇选取时就会做到迅速准确。

3 结语

生物科学是建立在实验基础上的学科[11]，实验是人才培养中不可忽视的教学环节，通过实验操作技能的训练，使学生能将理论知识与实践操作相结合[12]。在吉林大学植物科学学院本科遗传学教学实践中，安排2学时实验课，利用果蝇永久制片进行性状观察与性别鉴定，使学生轻松、迅速和准确地掌握了实验要求内容，取得了很好的教学效果，也为伴性遗传和遗传距离测定实验中，利用活体果蝇进行操作打下良好基础；果蝇永久制片也已经在黑龙江省海林林业局第一中学的生物实验课上得到了应用，受到师生广泛好评。