徐伟良 郭元晟,2 王福超,3 李春冬 安琪 雅梅,2 郭梁,2

(1.锡林郭勒职业学院生物工程研究院，内蒙古 锡林浩特 026000；2.锡林郭勒盟食品科学与检测实验中心/锡林郭勒盟农畜产品检验检测中心，内蒙古 锡林浩特 026000；3.延边大学农学院食品与生物科学系，吉林 延吉 133002)

锡林郭勒奶酪主要是指牛乳经过自然发酵凝乳最终形成的一种食物，属于锡林郭勒地区特有的传统固体类奶制品，也是锡林郭勒地区蒙古族传统奶制品中非常重要的一类食品。2020年经农业部审定，锡林郭勒奶酪成为国家农产品地理标志登记产品，其传统的制作工艺不仅展现着民族的文化特色与精粹，更包含着丰富的科学内涵与教育意义。锡林郭勒奶酪是一种多以凝乳酪蛋白为最终产品形式的高蛋白类乳制品，常见产品种类包括浩乳德(俗称奶豆腐)、毕希拉格(俗称熟奶豆腐)、楚拉(俗称奶渣子)、阿尔沁浩乳德(俗称酸奶豆腐)等[1,2]。日常生活中以四方块模具为主，在重大节日中则用不同的模具制作浩乳德。锡林郭勒奶酪其营养价值较高，含有大量的蛋白质、脂肪酸、维生素、钙、磷及微量元素。氨基酸比例平衡，必需氨基酸含量较高，消化率接近，脂肪酸含量较高，尤其是不饱和脂肪酸含量高，是老人小孩补充钙、磷、锌等元素的良好食物，补充人体各种必需营养，已成为蒙古族人们必需食物之一[3-5]。

锡林郭勒奶酪不仅含有大量营养成分和特色风味营养物质，更蕴含着优异发酵性能和特色风味等极其丰富的益生菌资源，对营养保健功能食品和商业发酵菌剂的研发开发具有巨大潜力，已越发受到研究人员的重视，逐渐成为益生菌资源研究的热点[6]。目前已有报道从锡林郭勒传统奶酪中分离得到了植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)和乳酸片球菌(Pediococcusacidi lactici)等一部分具有益生活性的乳酸菌[7-10]。本实验以锡林郭勒传统发酵奶酪为原料，通过产酸凝乳发酵性能为评价指标对优良发酵性能的乳酸菌株进行分离筛选，并以此用于生产加工均有良好营养品质的锡林郭勒奶酪，从而为锡林郭勒奶酪发酵剂的开发和新式奶豆腐品的研制提供技术依据。

1 实验器材与试剂

1.1 材料

试验菌株，由锡林郭勒职业学院生物工程研究院提供，其中编号B009系列乳酸菌株由锡林郭勒地区传统奶酪中分离获得。具体分离纯化步骤：将在牧民家采集的蒙古族传统奶酪(静置发酵奶酪、搅拌发酵奶酪)搅拌均匀，将其装入无菌采样袋中，并编号和记录，送回实验室，添加筛选抗生素后利用涂布法进行菌种分离。并挑取不同形态菌株于液体培养基中进行纯化及后续保存。

发酵用牛奶，采购于伊利集团市售灭菌纯牛奶。

1.2 培养基与试剂

MRS固体培养基购于北京路桥技术股份有限公司；TaKaRa快速提取试剂盒(Code No.9164)购于大连宝生物工程有限公司；其它试剂药品均为国药分析纯试剂。

1.3 仪器与设备

Eppendorf 5418R Centrifuge高速台式离心机，德国艾本德股份公司；Nanodrop 2000c核酸蛋白质分析仪，美国Thermo Fisher公司；2720 Thermal Cycler PCR扩增仪，美国BIO-RAD公司；琼脂糖凝胶电泳系统，北京六一生物科技有限公司。

2 实验方法

2.1 菌株产酸凝乳能力筛选

将51株菌取出并复苏后，用MRS液体培养基连续不间断活化3代，按2%的接种量接种于装有市售纯牛奶的试管中，放置于37℃的条件下进行培养。并以发酵8h时的酸度>80oT(吉尔涅尔度)及常温凝乳状态(有无凝乳、凝块是否均匀、润滑，乳清是否析出以及发酵感官风味)设为筛选的标准，进行产酸凝乳菌株的初步挑选。参照国标GB 5009.239-2016《食品安全国家标准食品酸度的测定》中的方法滴定样品酸度[11]。

2.2 菌株产酸凝乳能力复筛

将满足初步筛选条件得到的菌株，再次按照初筛的接种比例加入到100mL纯牛奶的三角瓶中进一步扩大培养，并以最终发酵8h时常温凝乳状态和加热凝乳状态(凝乳是否成团、凝块的颜色、乳清澄清程度、感官风味)综合因素作为筛选的标准，从而再次进行产酸凝乳菌株的复筛。

2.3 菌种PCR扩增及序列鉴定

采用TaKaRa快速提取试剂盒对筛选菌株的基因组总DNA进行提取。选用细菌通用引物(27F/1495R)用于扩增。引物序列分别为27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)，1495R(5′-CTACGGCTACCTTGTT ACGA-3′)。

PCR反应体系(20μL)，模板DNA 1μL、引物各1μL、ddH2O 7μL、Easy Taq PCR Super Mix 10μL。反应条件，94℃预变性5min；94℃变性1min、58℃退火1min、72℃延伸2min，共30循环；72℃末端延伸10min。

扩增产物用1.2%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，经检测后合格的扩增产物送至北京睿博生物科技有限公司进行测序，测序结果经拼接后在美国国立生物技术信息中心(national center for biotechnology formation.NCBI)进行BLAST同源比对。

2.4 奶豆腐的制作

2.4.1 奶豆腐制作工艺流程

菌种经过产酸凝乳能力筛选后，把筛选得到的3株菌按照1∶1∶1的比例混合制成复合菌种。在无菌条件下，将复合菌种按3%比例接种到1L市售全脂灭菌牛奶，然后放置于25℃常温下，模拟自然条件进行静置发酵24h。随后进行酸度滴定，若酸度达65oT以上，且发酵凝乳伴有少量乳脂析出，则发酵达到终点，否则继续发酵至终点。

制作流程：把发酵好的凝乳倒入锅中进行加热排乳清，温度控制在50～60℃，并保持10min，为了乳清的排出需要保持不停搅拌，并使其受热均匀；待凝块慢慢收缩至原来大小的1/2时，且凝乳富有弹性时，用滤网把乳清排出；将过滤掉乳清的凝乳块继续进行加热搅揉，温度控制在70℃以上，待凝乳经搅揉成团后，取出放入模具成型。

2.4.2 奶豆腐的品质评定

奶豆腐制作完成后，放在阴凉干燥环境下晾晒16h，挥发部分水分后计算奶豆腐得率，见公式1。抽选15位食品专业具有相关感官评定资质的检测人员以外观色泽、口感、气味、组织状态以及融水状态几个方面为标准对制作得到的奶豆腐进行感官评分，主要是对奶豆腐进行风味和质地的打分，评分标准见表1。并将奶豆腐样品参照国标GB 5009.3-2016[12]、GB 5009.5-2016[13]、GB 5009.6-2016[14]进行水分、蛋白质、脂肪检测。

表1 奶豆腐感官评分表

奶豆腐得率(%)=奶豆腐成品质量/原料乳的质量×100%

(1)

3 结果与分析

3.1 菌株产酸凝乳能力筛选结果

产酸能力通常是用于评价乳酸菌活力和筛选优良发酵性能菌株的重要指标。乳酸菌经过发酵后，会将乳中的乳糖、蛋白质等逐渐分解,不仅产生一些有机酸和小分子肽等营养成分，还能为发酵食物赋予一些独特的风味[15]。因此，产酸能力是乳酸菌发酵功能里的一个非常重要的指标，并且酸的生成能力与发酵时间成反比。此外，凝乳程度也是影响发酵乳制品生产过程中的关键因素，尤其是在蒙古族乳制品传统制作过程中，一般会通过调控加热凝乳过程来达到可控的产品品质与风味[16,17]。本实验对分离于锡林郭勒传统奶酪中的51株菌株，以37℃的条件下，发酵8h，酸度达到>80oT进行初筛，并以最终常温凝乳状态和加热凝乳状态等综合因素作为筛选的标准进行复筛。初筛结果见表2，复筛结果见表3。

由表2、表3可知，根据初筛标准，共有13株具有较好产酸能力的菌株，酸度均达到80oT以上，其中酸度最高可达87oT，且初筛菌株常温凝乳状态均相对较好。然后对初筛所得13株菌进行了复筛，最终得到了酸度、常温凝乳状态和加热凝乳状态均较好的菌株，分别为B009-074、B009-089和B009-092。

表2 菌株的产酸凝乳能力筛选

表3 产酸凝乳菌株复筛结果

3.2 菌种序列鉴定结果

为最终确定后续奶豆腐制作所用的发酵菌株，同时鉴别初筛菌种的多样性，因此将筛选所得的13株菌同时进行分子鉴定。总DNA提取和琼脂糖凝胶电泳验证，结果如图1所示(R1～R13)。序列测序同源比对后，鉴定结果见表4。由表4可知，经产酸凝乳筛选得到的13株分离于锡林郭勒传统奶酪中的乳酸菌经过测序后，结果显示皆为乳酸乳球菌(Lactobacillus lactis)，并且其同源相似性均为100%。这与前期研究文章中从蒙古族奶嚼口与下层凝乳中乳酸菌的筛选结果所得的种类相似，均为乳酸乳球菌[18]。此外，莫蓝馨等从16份锡林郭勒盟传统发酵乳制品中分离得到了105株乳酸菌株，多数归属于乳球菌属[19]。因此本实验最终筛选出的13株菌均为乳酸乳球菌(L.lactis)，与上述两位学者研究中的菌种属种基本相同。

图1 13株乳酸菌(R1～R13)的PCR扩增产物电泳结果注：R1～R13为产酸凝乳菌株复筛结果编号顺序。

表4 筛选菌株分子生物学鉴定结果

3.3 奶豆腐制作结果分析

3.3.1 奶豆腐感官品质评价

将筛选得到的3株乳酸菌按照1∶1∶1的比例混合制成复合菌剂加入到市售纯牛奶中进行自然发酵，并将发酵凝乳用于奶豆腐的制作。重复制作6个批次后，所制奶豆腐产品得率与感官评定如表5。由结果显示，经菌剂发酵制作的奶豆腐感观评分平均值在83.8分，整体感观评分较好，质地光滑，组织较细腻，但融水状态略差，受热易分散。制得奶豆腐平均得率为13.7%±0.81%，与传统奶豆腐加工生产得率(一般在10%左右)相比提高了37%。而据文献报道，王晓宇等[20]利用筛选所得菌种进行工业化生产奶豆腐时，通过对菌种添加量、发酵温度、排乳清温度以及搅和温度进行工艺优化后，奶豆腐出成率可达8.31%。由此可知，本实验所筛选的菌种进行奶豆腐制作时，产品得率显著提高，但产品整体感观评分略差，融水状态浑浊，受热易分散。这可能是由于在奶豆腐制作过程中上层乳脂析出较少，使得最终产品中含脂率偏高，这也由表6理化检测结果中得到验证，同时也符合王晓宇对含脂率偏低(<1.4%)的原料乳适合奶豆腐工业化生产的推断。

表5 奶豆腐产品得率与感官评分

表6 奶豆腐理化检测指标

3.3.2 奶豆腐理化品质评价

奶豆腐的理化检测指标数据见表6，可知水分平均含量为41.6%±3.7%，符合地方标准DBS15/001.3-2017要求(水分≤53%)[21]；蛋白质平均含量为21.9%±1.5%，略低于地方标准DBS15/001.3-2017要求蛋白质含量≥26%；脂肪平均含量为27.5%±2.1%，虽然此次重新修订的地标中未限定具体脂肪含量，但整体含量远高于原地方标准DBS15/001.3-2011要求≥10%，同时也高于文献报道奶豆腐脂肪含量在8%～25%。所制得奶豆腐理化检测显示蛋白质含量与地标要求的奶豆腐指标相比偏低，而脂肪含量相对偏高，这可能与奶豆腐制作工艺中的脱脂程度和晾晒脱水分程度有关[22]。如，奶豆腐根据水分含量可分为湿、半干、干3种产品类型，而依据产品类型的不同，奶豆腐的水分、蛋白质，脂肪及灰分等营养成分指标也有所不同[23]。由于本实验所使用的复合菌剂在制作奶豆腐时会出现脂肪上浮较少，使得脱脂程度降低，最终所得产品脂肪含量较高。因此，推断该复合菌剂可用于生产高脂型奶豆腐，而脂肪含量增加，不仅使产品的营养价值增高，更赋予了其独特的风味。

4 结论与讨论

本实验通过对分离于锡林郭勒传统奶酪中的51株乳酸菌进行优良发酵性能的筛选，以37℃的条件下，发酵8h，酸度>80oT进行初筛，并以最终常温凝乳状态和加热凝乳状态等综合因素作为筛选的标准进行复筛。共筛出了3株发酵时间短、凝乳组织状态好、具有良好感官风味的乳酸菌。并对其进行了序列测序以及同源比对，最终确定3株菌株皆为乳酸乳球菌(L.lactis)，且同源相似性均为100%。虽然所筛选得到菌株均为乳酸乳球菌，但菌株的发酵性能并不完全相同，这可能是由于所筛选的菌株隶属于乳酸乳球菌的不同亚种，而本实验利用细菌通用引物只能将菌种鉴定到种的水平，对于亚种还需进一步鉴定。

将筛选得到的3株优良发酵性能乳酸菌进行1∶1∶1混合制成复合菌剂，以此复合菌剂制作奶豆腐，所得产品整体感观评分较好，平均得率与传统奶豆腐加工生产得率相比提高了37%。所得奶豆腐整体脂肪含量相对偏高，由此推断，本实验所使用的复合菌剂在制作奶豆腐时会使脱脂程度降低，并利用所筛选菌株发酵生产奶豆腐所得产品得率与理化指标均有较好改进，可为锡林郭勒奶酪发酵剂的研发以及新型高脂型奶豆腐产品的生产提供一定的科学依据。