绝经后骨质疏松免疫防治新靶点：肠道菌群*

2021-11-30罗建周吴太林段春光陶惠人

中华骨与关节外科杂志 2021年8期

罗建周吴太林段春光陶惠人**

（1.深圳大学医学部，广东深圳 518000；2.深圳大学总医院脊柱骨病科，广东深圳 518000）

随着我国人口老龄化加剧，以骨质疏松为代表的老年性疾病愈发威胁着人们的健康，降低人们的生活质量[1]。目前骨质疏松的治疗主要集中于药物治疗，主要作用机制为抑制骨吸收和促进骨形成，而没有一种药物可以从根本上预防或逆转骨代谢失衡状态[2]。因此，探寻骨质疏松发病新机制及创新治疗具有重要的理论价值及临床应用前景。其中肠道菌群在骨质疏松发病机制的突破性研究进展为骨质疏松的防治提供全新的防治策略[3]。本文详细介绍肠道菌群免疫调节绝经后骨质疏松（postmenopausal osteoporosis,PMO）的最新研究进展，阐述肠道菌群免疫调控PMO 的主要作用机制，探讨肠道益生菌治疗PMO的疗效及应用前景。

1 骨质疏松概况

骨矿物质含量受遗传因素和环境因素共同作用，先天基因遗传因素决定60%～80%骨矿物质含量，而后天环境因素包括饮食、运动、光照等决定20%～40%骨矿物质含量[4]。正常人体发育过程中，骨量不断增加，在30～35 岁骨矿物含量累积达到峰值，随着年龄增大，骨矿物质含量逐渐下降，最后发展至骨质疏松。正常成年人骨骼系统中成骨细胞与破骨细胞功能相互协调、共同维持骨量相对稳定。绝经后女性雌激素水平骤然下降，诱发肠道菌群失调，激活免疫系统反应，打破骨骼系统的成骨细胞与破骨细胞功能的平衡，继而导致骨质疏松的发生发展[5]。

我国60岁以上人口近2.1亿，约36%患有骨质疏松，其中女性患骨质疏松比例更大，且更容易发生骨质疏松相关性骨折，最后导致终身残疾甚至是死亡[6]。目前绝大多数骨质疏松患者未得到有效治疗，而且治疗大多是补充钙剂或维生素D，疗效有限。Zhao 等[7]指出传统补充钙剂和维生素D 的治疗并不能有效降低老年人骨质疏松性骨折的发生率，不建议老年人常规补充。临床上常用的二膦酸盐、甲状旁腺素、降钙素、雌激素和单克隆抗体等抗骨质疏松药物有一定疗效，但是需要长期服用，降低患者依从性，增加经济负担，还会引起一些严重的毒副作用，如下颌骨坏死、股骨骨折、恶性肿瘤等[2]。目前亟需研究新的骨质疏松防治手段解决这一窘境，而肠道菌群成为潜力巨大的目标对象[3]。

2 肠道菌群概况

人类肠道寄居着数以万亿的微生物，其个体数量是人体细胞数的十倍，其基因总数是人类基因数的百倍[8]。人体肠道菌群源自于母体子宫和产道，出生时便存在，直至3 岁时稳定形成，拥有一定的自我调节能力，协助维持肠道内环境稳定[9]。目前研究发现胃肠道内生存着52个细菌门，其中厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门和变形菌门占主导地位，达肠道菌群总数的97%[10]。不同菌门之间的比例相对稳定，他们相互作用，共同形成一个平衡稳定的肠道微生物生态系统，并参与调控人体各大系统功能[11]。

肠道菌群可分为有害菌、中性菌和有益菌（益生菌）。以变形菌门为代表的有害菌能够刺激肠道局部和全身系统发生炎症反应，导致肠道通透性增加和宿主骨骼系统成骨细胞和破骨细胞功能的异常激活[12]。变形菌门主要包含α、β、γ、δ、ε 和ζ 型变形杆菌，临床常见的致病菌如致病性大肠埃希氏菌、志贺氏菌、沙门氏菌和耶尔森氏菌等都属于变形杆菌[12]。肠道中性菌主要包括大肠埃希菌、韦荣球菌和粪肠球菌，他们的功能具有双重性，在正常机体免疫的情况下，该类细菌对人体无害，甚至对益生菌有协同作用；当肠道菌群失调或其他因素刺激，中性菌群便会大量增生繁殖，扰乱肠道菌群生态环境稳定，减少有益菌的比例，最后会导致疾病发生[13,14]。肠道内最常见的益生菌主要包括酿酒酵母、乳酸菌、鼠李糖杆菌、植物芽孢杆菌、罗伊氏芽孢杆菌、嗜酸杆菌和双歧杆菌等[15]。益生菌能够将人体不可消化的碳水化合物分解为单糖，为日常活动提供能量；或者将单糖发酵成短链脂肪酸，参与调控人体各系统功能如免疫系统和骨骼系统；益生菌还可抑制有害菌和中性菌的过度生长繁殖，维持肠道内微生物环境平衡稳定[15,16]。

3 肠道菌群与免疫系统、骨骼系统的关系

婴儿早期肠道菌群来源于母体的子宫和产道，并随着生长不断发展演变，对促进机体健康发展和免疫系统的形成起重要作用[9,17]。正常肠道菌群的功能包括改善肠道通透性，促进营养吸收，减轻肠道炎症反应，参与骨骼系统的免疫调控[18]。研究表明，婴幼儿营养不良可以导致肠道菌群成分与比例不均衡，严重影响免疫系统发育成熟和骨骼系统生长[19]。这种病态菌群分布引起的免疫系统和骨骼系统发育不良的症状可以通过菌群传播，把营养不良儿童的肠道菌群移植至小鼠肠道可复制出相应营养不良小鼠模型，并引起骨量的显著下降[20]。Schepper 等[21]把骨质疏松模型小鼠的粪便移植至正常幼鼠后可同样发生骨质丢失。这种由病态肠道菌群分布导致的免疫系统和骨骼系统发育障碍症状可以通过改善菌群分布进行治疗。Schwarzer等[22]进行实验，给慢性营养发育不良的小鼠补充肠道益生菌后，观察到小鼠的体重、骨骼长度与厚度、生长相关激素水平都显著增加，促进发育不良小鼠生长、发育和成熟。Gehrig等[19]以婴幼儿、小鼠、小猪为研究对象的试验证实，补充微生物导向性食物能够改善营养不良引起的病态肠道菌群分布，减轻免疫炎症反应及增加骨量。究其根本，其内在机制可能是肠道菌群通过免疫系统调节肠道Treg 细胞与Th17 细胞的平衡，影响肠道乃至全身的免疫炎症状态，激活破骨细胞及成骨细胞功能，最终导致骨量发生改变[23]。Treg细胞可以分泌转化生长因子β1，抑制T细胞活化，限制炎症的发展与扩散，减少IFN-γ和TNF-α的生成，抑制破骨细胞活性[24]。Th17 细胞的作用是与Treg 细胞相互拮抗。Th17 细胞受致病菌刺激后会引发炎症反应，大量分泌IL-17 因子，聚集免疫细胞来吞噬、清除肠道易位的致病菌，同时也增加RANKL的表达，激活破骨细胞功能，增加骨吸收与溶解[25,26]。

4 PMO的肠道菌群特征

肠道菌群与PMO 的发生发展有着密切的联系。绝经后妇女雌激素含量骤然下降，肠道内微生物生态环境平衡的状态被打破，肠道益生菌减少，有害菌或中性菌增加，扰乱肠道局部乃至全身的免疫系统，刺激分泌大量破骨相关炎症因子，诱发骨质疏松[3,27]。Ma 等[28]实验证实，切除大鼠双侧卵巢的PMO模型大鼠的肠道菌群严重失调，厚壁菌门与拟杆门细菌比值显著增加，其中瘤胃球菌属、梭菌属和粪球菌属与破骨性指标呈正相关，并与去势大鼠骨量丢失的趋势一致；而肠道菌群中拟杆菌属和丁酸弧菌属却与骨量丢失呈负相关。除了动物模型探索PMO的肠道菌群变化外，也有学者在临床上做了相关研究，更深入揭露PMO 肠道菌群的变化规律。He 等[29]对106名绝经后女性进行肠道菌群检测，发现骨质疏松组细菌群落丰富度显著低于骨量减少组和正常组，其中骨量减少组主要以变形菌门为主，包括克雷伯氏菌、大肠杆菌/志贺氏杆菌、肠杆菌、柠檬酸杆菌、假单胞菌、琥珀弧菌和脱硫弧菌；而骨质疏松组则以异乳杆菌、乳酸菌和球拟杆菌更为丰富。肠道菌群失调与骨质疏松密切相关，学者们认为肠道菌群主要通过免疫系统的T 淋巴细胞（T 细胞）、B 淋巴细胞（B细胞）和炎性因子调控成骨细胞及破骨细胞功能，继而影响骨质疏松的发生发展[11,30]。目前肠道菌群作用于PMO 的相关机制并非十分明确，但比较清晰的调控途径主要有免疫系统炎症因子的调控、肠道菌群代谢产物的免疫调控和肠道菌群介导的肠道屏障通透性的相关调控[3,31]。

5 肠道菌群免疫调控PMO的机制

5.1 免疫系统炎性因子调控PMO

肠道菌群可调节肠道局部乃至全身的免疫炎症反应，对维持骨量动态平衡起着重要作用。临床观察发现，雌激素的水平与肠道菌群的多样性呈正相关，绝经前后对比，肠道菌群分布和比例发生显著改变，并影响肠道免疫状态，诱发骨矿物质含量丢失并引起骨质疏松的发生[27,32,33]。Li 等[34]实验通过抑制小鼠雌激素的分泌建立PMO 动物模型，实验发现缺乏雌激素的小鼠体内大量表达TNF-а、RANKL、IL-17A，体内大量激活破骨细胞，促进骨质的溶解和吸收，引起骨质疏松的发生；然而对于无菌小鼠由于肠道缺乏菌群激活免疫系统反应，雌激素缺乏时无法介导无菌小鼠体内大量分泌炎症因子，故不引起骨量的丢失。同样，Dar等[23]的实验证明，切除双侧卵巢后肠道菌群正常的小鼠较无菌小鼠显著增加Th17细胞和IL-6、IL-17、INF-γ、TNF-а 与RANKL 的表达，显著减少Treg细胞与IL-10的表达，破骨细胞前体细胞大量增殖和分化成熟，加速骨质丢失与骨质疏松的形成。Flores的团队[35]对比分析妇女绝经前后肠道菌群的变化,发现绝经后女性肠道菌群的多样性被破坏，尤其是厚壁菌门细菌比例下降最为明显。厚壁菌门细菌特别是梭菌具有免疫调节作用，可促进调节性Treg细胞的形成，增强其功能，维持免疫系统稳态，并且还可以抑制破骨细胞分化，影响破骨细胞形成[36]。肠道菌群是引起PMO 的重要媒介，绝经后妇女肠道菌群种属比例骤变，免疫细胞和炎性因子激增，促进破骨细胞分化成熟和功能，增强骨溶解吸收，引发骨质疏松。

5.2 肠道菌群代谢产物免疫调控PMO

肠道菌群发酵分解肠道内纤维素，产生大量短链脂肪酸，其中包括具有免疫调节功能的乙酸、丙酸和丁酸，诱导激活Treg 细胞，抑制免疫炎症反应[37]。Treg 细胞可抑制RANKL 的激活，从而影响破骨细胞的形成，起到维持骨量、减少骨溶解吸收，并且通过腺苷受体通路促进骨髓间充质细胞分化为成骨细胞，促进骨形成与再生[38,39]。Tyagi等[40]报道，小鼠摄入鼠李糖乳杆菌后血清中丁酸含量增加，并且肠道和骨髓中Treg细胞扩增，促进成骨细胞形成；给予无菌小鼠补充丁酸，同样可以观察到小鼠骨量、血清骨钙素和骨髓中Treg细胞增加；以抗体消耗Treg细胞后，阻断鼠李糖乳杆菌和丁酸诱导CD8+T 细胞增加Wnt10b 的表达过程，消除丁酸增加骨量的效果。鼠李糖乳杆菌增加骨量的前提条件是需要有肠道产丁酸细菌的存在，因为鼠李糖乳杆菌本身不会产生短链脂肪酸，但鼠李糖乳杆菌会促进肠道产生丁酸的细菌繁殖，协助增加肠道内丁酸的含量[41]。Flint等[42]对此给予证实，他们发现鼠李糖乳杆菌可增加肠道梭菌菌属的数量，后者被誉为肠道丁酸的中枢发生器，可在肠道内大量产生丁酸。Lucas 等[39]报道给予短链脂肪酸喂养小鼠可以显著增加骨量，改善小鼠卵巢切除后引起的炎症反应与骨质丢失，其机制可能与短链脂肪酸抑制破骨细胞分化有关。肠道菌群代谢产生的短链脂肪酸影响免疫系统的炎症反应，协调促炎细胞与抗炎细胞数量的平衡，影响炎性破骨因子表达，参与调控PMO。

5.3 肠道菌群介导肠道屏障通透性调控PMO

肠道屏障是抵御细菌侵袭的第一道屏障，主要由上皮细胞和紧密连接蛋白组成，把人体内环境与肠道菌群分隔开，维持着肠道菌群与宿主之间相对独立而又相互影响的平衡状态[43]。正常的肠道菌群起维持肠道屏障功能，增强肠黏膜紧密性，改善肠道局部及全身炎症反应；而病态的肠道菌群分布会破坏肠道屏障功能，增加肠道通透性，促使大量致病菌易位进入肠道内，触发肠道局部及全身免疫炎症反应，激活破骨细胞前体细胞大量增殖分化，加速骨量流失[44]。特别是绝经后妇女的雌激素水平骤然下降，肠道菌群紊乱，肠道屏障通透性增加，肠道致病菌大量易位进入肠壁内皮并激活免疫系统，分泌炎性破骨细胞因子并随血液循环流至全身，影响骨骼系统[32]。Li等[34]和Ma等[28]实验证实，PMO模型小鼠的肠道上皮细胞间紧密连接蛋白表达显著下降，肠道屏障通透性增加，易位进入体内毒素也随着增加，并激活免疫系统，显著增加促炎细胞Th17 细胞及炎症因子TNF-a、RANKL 和IL-17表达，诱导激活破骨细胞工作，加速骨质丢失。Edogawa 等[45]再次证实，肠壁屏障通透性受肠道菌群的变化影响，肠道菌群丰富度越高，肠道屏障通透性越低，而肠道菌群失调时肠道屏障通透性增加。调节改善肠道菌群分布，可上调肠道紧密连接蛋白表达，增强肠道屏障功能，减少血清内毒素含量，从而降低炎症反应，减少雌激素缺乏所致骨量丢失。

6 肠道菌群防治PMO的现状及前景

6.1 益生菌防治PMO

肠道益生菌通过介导免疫炎症因子的产生、改善肠道屏障通透性、代谢产生短链脂肪酸等机制参与调控PMO[3]。改善PMO人群的肠道菌群分布，阻断免疫细胞激活与聚集，减少炎症因子分泌，对维持肠道局部及全身免疫系统平衡，减少骨量丢失起到关键作用[18]。Jia 等[46]实验发现改善去势小鼠的肠道菌群分布后，小鼠血清中IL-17A、TNF-а 含量明显降低，炎症反应减轻，骨量丢失减少。Li 等[34]同样通过动物实验证实，补充外源性益生菌增加小鼠肠道益生菌含量，可以不同程度降低雌激素缺乏小鼠血清中的TNF-а、RANKL、IL-17A 的水平，减轻全身炎症反应，维持骨矿物质含量稳定，减缓骨质疏松发生。补充益生菌调节肠道菌群分布，同时也改善肠道通透性，维持肠道屏障功能，减少雌激素缺乏所致骨质丢失[47]。除动物实验外，一项临床双盲随机对照试验也得到相似的结果，补充益生菌能够显著降低血清肿瘤坏死因子含量，减轻全身炎症反应，降低骨转换率，减缓PMO 的进程[48]。肠道益生菌对PMO 具有正性的调节作用，可以用于骨质疏松的防治，但其作用效果有时间效应，补充益生菌的时间越早，持续疗程越长，降低骨转换率和增加骨量的效果就越明显[49]。

6.2 膳食纤维防治PMO

除了直接添加益生菌防治骨质疏松外，也可以通过高纤维饮食来达到增加肠道益生菌、保护骨骼系统、减少骨质丢失的目的。不可消化低聚糖（俗称益生元）是目前被认为是对骨骼健康最有潜力的益生纤维，包括低聚半乳糖、低聚果糖和菊糖[50]。低聚果糖喂养小鼠后，可以在小鼠结肠中观察到双歧杆菌明显生长和增殖，并且低聚果糖剂量越高，肠道内双歧杆菌相对丰度增加越显著。Chen 等[51]对切除双侧卵巢的小鼠给予口服乳果糖6周，发现乳果糖改变去势小鼠的肠道微生物群的组成，形成以梭状芽孢杆菌、大肠杆菌和拟杆菌为优势菌群的分布，增加去势小鼠血清中短链脂肪酸水平。口服乳果糖的去势小鼠可增加肠上皮紧密连接蛋白的表达，降低破骨细胞因子TNF-α、IL-6、RANKL 和IL-17 的含量，并增加肠道、外周血和骨髓中抗炎细胞因子IL-10的含量和Treg 细胞的数量[51]。Tousen 等[52]给予抗性淀粉喂养小鼠可以观察到肠道双歧杆菌数量增加，而且还可以增加抗炎因子IL-10 的表达，降低RANKL 的表达，减轻雌激素缺乏所致骨质流失。可溶性纤维饮食能够优化肠道菌群的分布，增加短链脂肪酸的生成，上调肠道紧密连接蛋白的表达，改善肠道通透性，减少炎性因子的产生，并增加肠道内钙离子吸收，减缓骨质疏松的发生[3,18]。这些研究都说明高纤维膳食饮食可以改善肠道菌群的分布，增加骨量，起到预防或减缓骨质疏松发生的作用。

6.3 肠道菌群防治PMO的其他途径

肠道菌群是治疗PMO 的新兴靶点，目前人们对该领域认识尚浅，仍有许多待挖掘和运用的方式调控肠道菌群，如噬菌体生物调控法。噬菌体作为一种数量庞大的肠道细菌病毒，对维持肠道屏障功能及调控肠道菌群的多样性和丰度起着重要作用[53]。临床研究证实，摄入靶向噬菌体能够选择性减少人体肠道大肠杆菌和产气荚膜杆菌的数量，降低炎症指标，并增加产生丁酸细菌的数量[54]。除噬菌体调控法外，学者们还可通过粪便微生物移植法替换掉原病态的肠道菌群，重建正常的肠道菌群分布，恢复菌群与宿主互利共生的平衡模式[11]。临床上粪便移植法主要应用于肠道难治性感染和炎性肠病的治疗并取得较好的效果，但其安全性仍需进一步研究确证[55]。一些物理方法也发挥着调控肠道菌群的功能，如阳光能够通过“肠-皮肤轴”增加肠道的有益菌群，显著提高维生素D缺乏者肠道菌群的α和β多样性，恢复正常肠道菌群丰度，这可能与阳光暴露刺激人体免疫系统，使之释放炎性调控因子，调控肠道菌群微环境相关[56]。