陈丛，赵敏

宫颈癌是妇科常见的恶性肿瘤之一，严重影响妇女健康。由于宫颈癌病因明确，且疾病的发展需要数十年的时间[1]，作为可防可治的肿瘤，预防宫颈癌的有效措施依然是宫颈病变的筛查。目前宫颈病变筛查采用“三阶梯的方式”，而用于普查的宫颈薄层液基细胞学检查（thin-prep cytology test，TCT）具有特异度高、敏感度低的特点，高危型人乳头瘤病毒（high risk human papillomavirus，HR-HPV）检测具有敏感度高、特异度低的特点，在临床中的作用受限。众所周知恶性肿瘤的发生与抑癌基因杂合性丢失、基因突变和异常甲基化等导致正常细胞功能丧失、增殖失控有关。其中，DNA 甲基化是抑癌基因功能失活和转录抑制的关键机制之一，基因启动子过甲基化已被证实在宫颈癌等肿瘤中普遍存在[2]。随着对宫颈病变研究的深入，特异性的DNA 甲基化标志物检测成为一种新兴的筛查策略，可预测宫颈病变进展的风险。

1 宫颈病变筛查现状

宫颈病变筛查始于宫颈脱落细胞学检查，现阶段用于普查的TCT 检测方式受取材方式、人工阅片等主观性影响，导致检测结果易出现偏差。细胞学P16/Ki67 检测是目前预测宫颈病变的研究热点。P16INK4a（P16）是一种细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂，已被证明在致癌型HPV 的转化感染中过表达，并被认为是宫颈癌前病变的替代标志物[3]。Klaes等[4]的研究表明，P16 免疫组织化学染色可以精确识别小的宫颈癌前病变及宫颈癌。Ki67 是一种核抗原和细胞增殖生物标志物，在细胞周期的G0 阶段不表达，在细胞有丝分裂期间表达达到峰值，一直是测量和监测肿瘤细胞增殖的标志物。宫颈病变的相关研究发现，Ki67 的阳性表达随着宫颈病变程度的加重而增加[5]。但是也有研究发现，P16/Ki67 双重染色对CIN2 的阳性检出率低于对CIN3+的阳性检出率（41.1%vs.86.9%）[6]。

HR-HPV 持续感染被认为是宫颈癌前病变进展到宫颈癌的主要因素，21 世纪初，HPV DNA 检测由于其高敏感度被用于宫颈病变筛查。但随后研究发现，临床上HPV 阳性患者多为“一过性感染”，可在1～2 年内清除，不会引起前驱病变或恶性肿瘤，故HPV 检测结果的假阳性率较高。HPV 致癌的关键在于基因组整合入宿主细胞发生病毒癌基因E6、E7的过表达，刺激细胞进入无限增殖状态，导致癌变。以HPV 的致癌基因E6、E7 转录的mRNA 为靶点，根据转录情况来判断HPV 的感染及病毒活性状态，可以区别感染性质，排除“一过性感染”，更有效地反映病变的进展，减少不必要的阴道镜转诊。

宫颈病变筛查的目的在于及时筛查出高级别鳞状上皮内病变（high-grade squamous intraepithelial lesion，HSIL），但是基于我国国情，大部分宫颈病变筛查仍选用单一的TCT 检查或用HPV DNA 检测分流TCT 结果异常的方式，造成了临床工作中宫颈HSIL 的漏诊或过度诊断。

2 DNA 甲基化与宫颈病变

恶性肿瘤通常是由遗传和表观遗传改变的积累引起的，最近的证据表明，特定基因的表观遗传变化可能介导或预测致癌进展。基因的表观遗传学调控包括DNA 甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑和非编码RNA调控等，其中基因启动子区的异常DNA 甲基化是癌前和恶性阶段中公认的最常见的表观遗传学标志。它通常发生在肿瘤抑制因子、转录因子和细胞周期调节因子基因的CpG 二核苷酸中的胞嘧啶上，通过启动子沉默抑制基因表达导致整体低甲基化和基因特异性高甲基化，在包括宫颈癌在内的致癌机制中起关键作用[7]。宫颈组织中DNA 甲基化包括宿主基因甲基化和HPV DNA 甲基化，可采用甲基化特异性定量聚合酶链反应（PCR）检测、焦磷酸测序以及最近发现的各种基于芯片的深度测序等方法进行检测。目前在宫颈组织中已检测出超过100 种甲基化标志物，近20 种在文献中被报道，其中约有10 种基因的甲基化水平在宫颈HSIL 和宫颈癌中升高[8]。DNA 甲基化异常不仅被证实与宫颈癌治疗后的随访及远期预后密切相关[9]，由于其具有较高特异度，故现阶段也正被开发作为宫颈病变筛查策略的附加工具。

2.1 宿主细胞甲基化预测宫颈病变宿主细胞DNA 甲基化是来自宿主的细胞防御机制，沉默入侵的外来病毒基因组并抑制病毒复制。由于其检测具有自动化、客观性，不依赖于分子形态学及主观解释，且对宫颈HSIL+的检出有较高特异度，既可以用作分流HPV DNA 阳性患者，又可以用在缺乏专业病理医生的地区。目前已知可以预测宫颈病变的宿主细胞甲基化的基因包括配对盒家族基因1（PAX1）、性别决定区域Y 盒1（SOX1）、锌指蛋白582（ZNF582）和细胞周期调节蛋白1（CCNA1）等。

2.1.1 PAX1 PAX 基因编码一个由9 个转录因子组成的家族，这些转录因子在正常表达的组织中充当细胞谱系特异性调节剂，被认为是恶性肿瘤进展的重要因素。PAX 基因家族根据基因结构分为4 组，包括PAX1/9、PAX2/5/8、PAX3/7 和PAX4/6。PAX1位于染色体20p11.2 上，是PAX 家族中甲基化最频繁的基因[10]。PAX1 可能参与浸润性或侵袭性恶性肿瘤的癌变和肿瘤进展，如宫颈癌、口腔癌和卵巢癌。Lai 等[11]首次报道了PAX1 异常甲基化与宫颈癌相关。Nikolaidis 等[12]的荟萃分析纳入了1 385 例不同级别的宫颈上皮内瘤变（CIN）患者和正常对照者，发现CIN3+与正常对照样本中PAX1 甲基化的敏感度和特异度分别为77%和92%。Liu 等[13]研究认为，当鉴别宫颈恶性与非恶性病变的临界值（△Cp 值）的截断值为13.28 时，PAX1 甲基化检测的敏感度、特异度和受试者工作特征（ROC）曲线下面积（AUC）分别可达92.30%、78.60%和0.902，其阳性预测值为80.00%，阴性预测值为91.67%。在检出CIN3+方面，与HPV 检测相比，PAX1 甲基化检测的特异度及阳性预测值显著增高（93.3% vs.60.0%，87.0% vs.57.1%）[14]。因此，若PAX1 甲基化与HPV 联合检测或分流HPV DNA 阳性患者可以提高宫颈病变筛查的准确性，避免临床工作中过度转诊阴道镜。

2.1.2 SOX1 SOX 基因是一类Y 染色体性别决定区（sex determination region of Y chromosome，SRY）相关基因构成的基因家族，其参与胚胎发育和凋亡过程中转录因子的编码，与Wnt/β-连环蛋白信号通路有关。SOX 基因的异常表达可以激活β-连环蛋白信号通路，促进β-连环蛋白分解，抑制β-连环蛋白的活性，从而影响胚胎发育和肿瘤形成。SOX1 基因是SOX 基因家族的成员，参与多种肿瘤的发生和进展。例如，SOX1 甲基化水平在肝癌、口腔鳞状细胞癌和宫颈癌组织中显著升高[15]。Lai 等[16]研究认为，SOX1甲基化是CIN3+检测的一个潜在的生物学标志物，在CIN3+患者中SOX1 甲基化发生率为100%。一项荟萃研究纳入了918 例CIN3+患者和2 193 例CIN2-患者共14 项相关研究，发现SOX1 启动子的高甲基化在区分CIN3+患者和CIN2-患者时的AUC为0.838，敏感度和特异度分别为75%和71%，用于评估综合敏感度和特异度数据准确性的诊断优势比（diagnostic odds ratio，DOR）为11.12（＞1），表明SOX1甲基化对CIN3+的筛查具有重要的诊断价值[17]。在与HPV 相关的研究中发现，HPV 阳性联合SOX1 甲基化检测较单独HPV 阳性诊断CIN3+的准确性显著升高（69.8%vs.27.9%）[18]。

2.1.3 ZNF582 KRAB-锌指蛋白家族参与调节DNA 修复、细胞周期和组织转化等生理过程。既往研究表明，ZNF582 甲基化与宫颈癌有关，且ZNF582甲基化检测提高了目前宫颈病变筛查的有效性，并将不必要的阴道镜检查和活检转诊减少了60%[19]。有研究发现，当截断值为0.62 时，ZNF582 检测CIN3+的敏感度和特异度分别为70%和82%，AUC可达到0.80[20]。对未明确诊断意义的不典型鳞状上皮细胞（ASCUS）人群进行研究发现，ZNF582 甲基化检测CIN3+的敏感度为91.4%，特异度为95.0%，且AUC 大于PAX1 甲基化检测和HPV 检测（0.96 vs.0.92 vs.0.67）[21]。在HPV相关研究中发现，当ZNF582 的截断值≤11 时，ZNF582 联合HPV16/18是检出CIN3+的最佳组合，其敏感度为85.4%，特异度81.1%[22]。

2.1.4 CCNA1 CCNA1 是一种肿瘤抑制基因，在HPV E6 和E7 蛋白嵌入宿主细胞后被激活，导致恶性肿瘤发生。2014 年Khunamornpong 等[23]研究发现，正常宫颈、低级别鳞状上皮内病变（LSIL）和HSIL 的CCNA1 甲基化水平不同，分别为0、2.88%、83.33%。Oranratanaphan 等[24]研究显示，CCNA1 甲基化的阳性预测值高达80.0%，可以用于分流ASCUS 阳性患者。诊断宫颈HSIL 时，尽管CCNA1 甲基化检测的敏感度低于HPV 检测（83.33%vs.100%），但特异度显著高于HPV 检测（96.88%vs.21.88%），可以用于与HPV 联合筛查或分流HPV 阳性患者[25]。

此外，还有其他基因启动子甲基化被认为是预测宫颈病变的标志物。Bu 等[26]研究发现趋化因子成员A4（FAM19A4）与细胞学分级呈正相关，甲基化率由低到高依次为正常宫颈组织、LSIL、HSIL、宫颈癌（10.61%、35.48%、56.14%和93.44%）。细胞黏附分子1（CADM1）和T 淋巴细胞成熟相关蛋白（MAL）启动子的甲基化可能与宫颈病变进展相关。有研究表明，宫颈炎症标本中CADM1 和MAL 启动子的甲基化水平是正常宫颈组织的1.5 倍（P＜0.05）[27]。由于持续炎症与宫颈病变进展风险升高相关，推测CADM1 和MAL 启动子的甲基化水平升高可能出现在组织破坏中，推动宫颈病变进展。连接黏附分子3（JAM3）通过细胞间的黏附及相互作用，调节肿瘤细胞生长，能够显著提高特异度和阳性预测值，对于ASCUS 患者，尤其是小于30 岁的患者有一定的分流效能[28]。

2.2 HPV 病毒基因甲基化预测宫颈病变目前认为，HR-HPV 持续感染是宫颈癌前病变进展到宫颈癌的主要因素，HPV 病毒基因分型以及病毒癌蛋白E6/E7 的转录水平已被用作预测宫颈病变进展的重要生物学标志。HPV 感染进展也与HPV DNA 甲基化模式有关，宫颈HSIL+中HPV DNA 甲基化水平更高，因此HPV DNA 甲基化正被用作宫颈病变筛查的新标志物。HR-HPV 病毒通过宫颈上皮的微伤口进入，HPV 病毒衣壳蛋白L1 和L2 附着在基底膜上，2～4 h 后被内化，导致基底上皮细胞感染。病毒基因组是作为染色体外环状附加体建立的，可以参与细胞转录和复制。HPV DNA 甲基化可能是宿主对感染的反应，但也可能是病变向肿瘤进展的表现。目前研究主要集中在HPV L1、L2 区域CPG 位点的甲基化。有研究指出，HPV31、HPV18 和HPV45 在L2 和L1具有高甲基化区域，且在CIN3 病毒CpG 位点甲基化增加[29]；HPV16 晚期启动子内病毒CpG 位点的甲基化率可能随着病变（炎症-LSIL-HSIL-癌）的程度变化而增加，在宫颈LSIL、HSIL 及宫颈癌样本中，甲基化率分别为13.6%、31.9%和83.1%。与TCT 检查相比，HPV DNA 甲基化检出宫颈HSIL 的敏感度（80.0% vs.76.6%）及约登指数（0.46 vs.0.31）均较高，且不需要细胞学标本制备设备，表现出HPV DNA 甲基化检测即时分诊CIN3+的潜力[30]。

3 结语与展望

选择最优的联合筛查技术进行宫颈病变筛查，是为了使低级别病变与高级别病变完全分化。既要避免自然消退的HPV 感染患者不必要的手术所导致不良影响，同时也要及时检测疾病进展防治癌前病变进展到癌。DNA 甲基化是临床研究中改进诊断、分期和预测的良好生物学标志物，对于检出宫颈HSIL+有潜在作用。但是DNA 甲基化作为单一筛选工具的效用有限，联合HPV 检测或分流HPV DNA阳性患者，既可以弥补TCT 检查的主观性，又可以避免HPV 检查假阳性造成的过度转诊阴道镜，可能是一种合理的筛查选择。