池肇春

山东省青岛市市立医院消化科 (山东 青岛， 266035)

1 概述

在哺乳动物中，血红素的分解代谢必不可少。血红素首先被血红素加氧酶(HO)裂解成线性四吡咯胆绿素Ⅸα(BV Ixα)，然后由胆绿素还原酶(BVR)转化为胆红素。HO利用NADPH细胞色素P450氧化还原酶(CPR)提供的3个氧分子(O2)和7个电子打开血红素环，BVR通过烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)降低胆绿素。HOs的结构研究，包括底物结合、反应中间结合和几种特定的抑制剂结合形式，揭示了底物与HO结合的细节和HO反应过程的机制。低温捕获结构和检测远端配体与血红素铁之间键的光解的时间分辨光谱研究表明，在HO反应过程中产生的CO是如何从反应位点解离的，HO的构象发生相应的变化。含有HO和CPR的复合物结构提供了电子如何转移到血红素HO络合物的详细信息。尽管BVR及其与NAD+的配合物的三级结构早在10多年前就已确定，但其催化残基和反应机制仍不清楚。最近的一项关于蓝细菌BVR与NADP+和底物BV的结晶学研究澄清了这些问题。两个BV分子以堆积的方式与BVR结合，其中一个BV可以协助另一个BV的还原催化。最新生化、光谱和晶体学的研究，详述了化学基础上的分子机理的HO和BVR反应[1]。HO特异地切割血红素的α位置，生成BV，Fe2+的线性四吡咯和CO。近年来，CO和NO都被认为是重要的信号分子。

CO通过NF-κB通路参与炎症、细胞增殖和分化。该分子通过半胱氨酸β合成酶途径还调节血管扩张和血管收缩。通过神经元PAS结构域蛋白2(NPAS 2)途径调节昼夜节律,并存在细胞生长、分化凋亡、肿瘤生长抑制等多方面作用[2，3]。

哺乳动物HO由一个可溶性催化结构域和一个C末端膜结合段组成。HO与底物血红素形成1∶1复合物，并将其转化为BV。具体而言，从血红素转化为α-羟基血红素，再从α-羟基血红素转化为α胆绿蛋白血红素(α-verdoheme)，最后从α-verdoheme转化为BV[4]。第二步和第三步分别释放CO和黑色铁。哺乳动物HO需要电子来进行这些单加氧酶反应，这些电子由NADPH-细胞色素P 450氧化还原酶(CPR)提供。

如果胆红素不被氧化为胆绿素，则UDP-葡糖醛酸转移酶1A1(UGT1A1)与肝细胞中的葡萄糖醛酸结合，使其更易溶于胆汁。结合胆红素通过ATP依赖的多药耐药蛋白转运体MRP[5]，一旦进入肠道，结合胆红素就会被微生物区系还原为尿胆红素原，并进一步代谢为甾体比林或尿比林，它们分别在粪便和尿液中排泄[5-7]。然而，胆红素并不仅仅是血红素分解代谢的废物，它也是一种有效的抗氧化剂，特别是保护脂质免受氧化。在过去的10年里，胆红素的作用已经扩大，为一种炎症保护的工具[8，9], 包括糖尿病、心血管疾病、代谢综合征、肥胖等疾病，特别是慢性肝病。据报道，在接受常规健康筛查的患者中，血清总胆红素水平升高与代谢相关脂肪性肝病(MAFLD)和代谢相关脂肪性肝炎(MASH)呈负相关[10]。在肥胖儿童中，经肝脏超声诊断为MAFLD者血清总胆红素水平低于无MAFLD者。Puri等[11]调查诊断为MAFLD的儿童，观察到MASH患者血清总胆红素水平显著降低,此外，血清总胆红素水平与脂肪变性程度和MAFLD活性评分呈负相关(P<0.05)。这些研究支持胆红素对慢性肝病的进展和发展起到保护作用。

2 HO的性质

哺乳动物HOs是一种重约33 kDa的蛋白质，C末端段锚定在微粒体膜上，截短的可溶性HO形成单体。该蛋白有两种亚型，即HO-1和HO-2。HO-1在脾脏和肝脏中高表达，主要由衰老的红细胞降解血红素。HO-2对HO-1的诱导剂完全不敏感，在大脑和睾丸中都有表达。蓝藻和植物的HOs是可溶性蛋白，以多种亚型形式存在。

HO在特定的位置与血红素结合，形成血红素-HO配合物，然后激活分子氧(O2)使用底物血红素。HO的血红素配合物具有与其他血红素蛋白类似的光谱性质，如肌红蛋白和血红蛋白[12]。铁血红素-HO配合物在中性pH下以六配位高自旋态存在，经Raman光谱和EPR(电子顺磁共振)光谱分析，在碱性pH下转变为低自旋态[13]。保守的残基位于N端附近，被认为是血红素铁的配体。血红素-HO的一个特点是它对CO的亲和力与O2的亲和力几乎相等。众所周知，其他血红素蛋白如肌红蛋白和血红蛋白对CO的亲和力远高于O2。激活O2是HO反应的关键过程。HO是一种α螺旋蛋白。血红素群被A-、B-和F-螺旋包围，血红素铁由His残基(大鼠HO和人HO中His 25)在A-螺旋中协调。F螺旋位于血红素的远端。有趣的是，血红素的远端没有侧链，与血红素铁最接近的残基是甘氨酸。晶体结构分析表明水分子或OH-在铁血红素结合状态下与血红素铁配位。血红素的取向是由HO的碱基残基与两个血红素丙酸基团之间的静电相互作用维持的。对电子密度图的仔细观察发现，血红素的一小部分在连接α和γ位置的轴心周围以倒转的方式与HO结合，这与核磁共振分析结果是一致的[9]。

3 血红素结合对HO结构的影响

在大鼠载脂蛋白血红素加氧酶-1(apoHO-1)的晶体结构中，血红素结合位点发生了较大的构象变化。用核磁共振技术测定了大鼠HO-1的构象动力学，阐明了HO-1识别血红素的机制[14]。核磁共振弛豫实验表明，在晶体结构中，大鼠apoHO-1A-、B-和F-螺旋发生波动，并与表面暴露环(CD-环)和CD-环瞬间形成部分展开结构。波动的CD-环位于血红素结合位点的17个以上，这个环的功能是未知的。在试图阐明这一环的功能时，发现有趣的突变改变了活动，但几乎没有引起构象的变化。CD环中苯丙氨酸79丙氨酸(Phe79Ala)突变通过促进构象波动调节血红素结合的构象变化。此外， CD-环接近CPR在CPR-HO复合体中的交互位置。因此，血红素与HO-1的结合可能通过控制血红素结合位点和CD环的波动而影响CPR与HO-1的亲和力。

4 CO或氰化物结合血红素引起的构象变化

血红素与Lys 179之间发生氢键的断裂。此外，在CO结合的血红素-大鼠HO-1晶体中，当Fe-CO键被光解时，观察到远端F-螺旋和血红素铁的反构象变化[15]。用时间分辨共振拉曼光谱观察了血红素-血红素-HO-1配合物在CO解离后的这种动态结构变化[16]。在亚纳秒和微秒时间分别观察到组氨酸铁(Fe-His)拉伸和丙酸血红素弯曲共振拉曼谱带的时间变化。这些变化表明，在CO解离后，Fe-His键的结构重排和血红素丙酸盐桥的结构重排。Fe-His拉伸模式在解离后表现出高达30 μ的上移，这是第1个例子，在CO解离引起的伸展Fe-His连接在血红素蛋白。

5 BV铁螯合配合物HO的结构

当HO反应第3步完成时，生成血红素裂解产物BV-铁螯合物，从HO中释放出Fe2+和BV。测定了BV-铁螯合铁结合大鼠HO-1的晶体结构，发现BV-铁螯合铁的四吡咯部分呈扭曲的U形构象(zzz、sss构型)[17]。在电子密度图中未发现暴露于表面的丙酸基团。铁原子到5个氮原子的距离，包括His 25的Nε原子，相对于血红素-HO-配合物中观察到的氮原子的距离增加。保留了包括Asp140在内的氢键网络。当该结构与胆绿蛋白血红素-血红素加氧酶(verdoheme-HO)结构相比较时，血红素远端的构象发生了明显的改变。F-螺旋位的氢键方案由π-螺旋构象转变为α螺旋构象，而G_(139)羰基氢键伙伴由G_(144)酰胺基改变为G_(143)。这种微妙的变化导致F-螺旋的方向改变，血红素口袋变宽。因此，Fe3+原子和BV可以从HO中释放出来，Fe3+原子被还原。

6 抑制HO活性的化合物

包括金属卟啉抑制剂在内的几种HO抑制剂。在这些HO抑制剂中，合成了咪唑-二恶烷类化合物作为哺乳动物HOs的抑制剂。这类抑制剂的特点是在诱导性HO-1和组成性Ho-2酶之间具有选择性。大量的抑制剂分子占据了狭窄的远端口袋，导致远端F-螺旋的开放构象和远端氢键网络的替换。血红素丙酸基团的构象变化与CO引起的构象变化相似。生物化学表征显示，在咪唑二氧戊环化合物(DIOCPI)与抑制剂结合的血红素与氧的反应性相比，形成二氢萘后，HO-1和HO-2的催化反应完全停止。这一结果主要是由于抑制剂结合的钒与氧的反应性较低所致。DIOCPI的4-氯苯基占据了由苯丙氨酸和蛋氨酸残基的侧链组成的疏水腔，其中CO被瞬间捕获。DIOCPI占据血红素铁的远端，从而抑制血红素-HO向O2的转化。然而，生化研究表明，DIOCPI严重抑制了胆绿蛋白血红素向胆绿素-铁螯合物的转化[18]。合成了多种化合物来选择性地抑制HO-1和HO-2，通过对相关咪唑-二恶烷类化合物与人类HO-1结合方式的研究发现，所有这些化合物都以类似的方式与HO-1结合[19]。虽然对具有高选择性的抑制剂进行了广泛的研究，但这些化合物对HO-1和HO-2选择性的结构机制仍不确定。

据报道，替代化合物在血红素的远端结合，这些化合物通过破坏氢键网络而抑制HO的活性[20]。DL-二硫苏糖醇(DTT)和二硫代赤藓醇(DTE)具有较高的亲和力。DTE对HO -1的选择性比HO-2较高，测定了DTT-和DTE结合的大鼠血红素-HO-1和血红素-HmuO(HmuO基因是白喉棒状杆菌利用血红素和血红蛋白作为铁源所必需的；HmuO的产物与真核生物血红素加氧酶具有同源性，后者参与血红素的降解和铁的释放)的晶体结构。DTT与巯基末端的血红素铁结合，两个羟基与环境氨基酸相互作用。在DTT-血红素-HO-1和DTE-血红素-HmuO配合物中，DTT和/或DTE占据血红素的远端，且缺乏HO反应所必需的氢键网络[1]。

7 哺乳动物的BVR特性

HO产生的BV被BVR进一步转化为胆红素。从大鼠肝、猪脾和人肝中分离纯化BVRs。据报道，BVR以两种异构体的形式存在，即BVR-A和BVR-B。BVR-A是成人肝脏中主要的BVR形式，催化α-位血红素裂解产物BV(Ⅸα)还原成BR(Ⅸα)。BV(Ⅸβ)是另一种位于β位置的血红素裂解产物，被BVR-B还原形成B(Ⅸβ)。在成人中，BV异构体的比例为95%～97%Ⅸα和3%～5%Ⅸβ。

8 BVR的晶体结构

在20年代初对大鼠BVR进行了晶体化和晶体结构测定[21]。BVR由两个结构域组成，即N-末端二核苷酸结合域和C-末端结构域。N端二核苷酸结合域由一个α/β二核苷酸结合基序组成，这是一个典型的罗斯曼折叠，其中一个平行的β片被6个α螺旋包围。C终端领域最显著的特点是一个大的、扁平的、六股β片。这张纸的一面主要是极性和带电残留物的溶剂，从而形成一个平面表面在分子的一端。NAD配合物大鼠BVR晶体结构的研究也确定了，NAD+被绑定到N端和C端域之间的缝隙上[22]。在大鼠BVR中，NAD氢原子周围的残留物包括Tyr 97、Ser170和Arg 172。将这些残基突变为其他残基不会导致完全失活[23]。虽然基底BV可能在该位点附近结合，但确切的BV结合位点和模式尚不清楚。

9 BVR的新功能

最近的研究已经建立了新的功能，其中之一是DNA结合能力。Maines小组报告，人类BVR与HO-1启动子区域(称为ap-1位点)结合和激活转录因子-2(ATF-2)启动子，ATF-2是激活cAMP反应元件cAMP的转录因子, 是碱性亮氨酸拉链蛋白家族中与特定序列相结合的DNA结合蛋白。在调控正常细胞的生长发育、应激反应、DNA损伤应答中发挥作用。ATF-2需形成同二聚体或与其他bZIP蛋白如c-Jun形成异二聚体而发挥转录活性。ATF-2具有致癌与抑癌双重功能[24]。这些启动子区域具有相似的序列(TGTAGTCA)。因此，通过调节HO-1和ATF-2的表达，使人的BVR在细胞信号传导中发挥作用是可行的。

BVR的另一个未被发现的特点是它作为丝氨酸/苏氨酸激酶的功能。氧自由基促进BVR激酶活性，该酶在cGMP和氧化应激作用下的活性与BVR易位到细胞核中同时存在[25]。BVR的氨基酸序列包含一个碱性亮氨酸拉链(basic leucine zipper,bZip)样的基序，bZip是一种转录因子，它通常存在于受细胞信号调节的激活剂中，对基因表达与调控起重要作用[26]。

综上所述，这些观察证实BVR是一种多功能酶。然而，BV还原、DNA结合和激酶活性等功能的分子机制尚不清楚。需要进一步的研究才能确定BVR的确切生理作用。