张翡艳

摘要：血小板作为人体血液中的重要成份，在生理性止血中起着非常重要的作用。新鲜液体保存血小板，最长保存时间仅为5天，而冰冻保存血小板明显延长了血小板保存期限，满足了临床急症出血病人的需求。冰冻保存可能是维持生物细胞、组织活性的最理想的方法之一，也是许多研究人员目前致力研究的方向。然而，因为其保护剂选择、保存及质量标准等仍未能达成共识，使得冰冻血小板的使用未能形成国标。本文对冰冻血小板国内外研究进展做了综述。

关键词：冰冻血小板  二甲基亚砜  国家战略储备物资

【中图分类号】R331.1             【文献标识码】A             【文章编号】2107-2306（2021）11--03

在医学技术不断发展的今天，随着各种移植手术、高难度手术的增多，输血治疗在临床上的作用日趋体现，成分输血被广泛运用，特别是强化疗和骨髓移植的迅速开展，临床上对血小板的需求急剧增加。新鲜液态血小板的常规保存条件为（22±2）℃、震荡保存5天，其虽具有良好的功能，但因采集新鲜液态血小板耗时长、保存期短，易造成细菌污染，使用前需要提前预约，因此无法保障临床急診患者的需求，特别是偏远地区。深低温冰冻保存是维持细胞、组织活性，保留新鲜血小板生理功能的较理想的方法之一，具有保存期长、可以大量储备并且随需随取、供应及时等优点，尤其可用于特殊血型血小板和自体血小板储备。本文对目前冰冻血小板保护剂的选择、制备、应用等方面的研究进展做综述如下，以期为深低温冰冻保存血小板的研究及应用提供参考依据。

1 制备冰冻血小板保护剂的选择

常用的保护剂可分为深低温保护剂、冰冻干燥保护剂和低温冷藏保护剂三大类。

深低温保护剂又根据其能否通透细胞膜分为非通透性低温保护剂和细胞膜通透性低温保护剂。其中，常用的非通透性低温保护剂有聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯二醇、乙烯乙二醇、白蛋白等。细胞膜通透性低温保护剂如：二甲基亚砜、甘油等。多种深低温冰冻保护剂联合使用改善低温冻存效果，渗透性和非渗透性保护剂的联用可以改善低温冻存效果已经被证。通常认为非渗透保护剂与渗透性冰冻保护剂联用能降低冰冻保护剂的细胞毒性，但是Lawson等的研究表明：多种深低温保护剂的联用增加了其细胞毒性，联用的深低温保护剂在增加细胞毒性方面有协同作用，深低温保护剂联用不像以前想的那样有益无害。

冰冻干燥保护剂常用的有海藻糖，低温冷藏保护剂如尿嘧啶二磷酸半乳糖。有研究者将几种保护剂混合使用，如二甲基亚砜与羟乙基淀粉联用，还有二甲基亚砜与海藻糖联用、二甲基亚砜与第二信使调节剂的混合物（TS）联用等，多种低温保护剂的联合使用虽取得一些进展，但未达到理想状态，达不到设计初衷，在保护剂的选择搭配以及浓度选择上有待进一步研究。尽管血小板低温保护剂及使用方法有很多种，但是目前常用及研究最多的深低温冰冻保护剂主要是单纯选用5%-6%二甲基亚砜作为保护剂。

不论何种保护剂，其目的最主要的是在低温处理过程中能够保护细胞膜及细胞骨架的完整性，其次还应该考虑细胞毒性、避免血小板激活等问题。大量研究表明二甲基亚砜有许多优势，如低细胞毒性、分子量小、强渗透性、易于穿透细胞、可使细胞内冰点下降、提高包膜对水的通透性、减少细胞内冰晶形成、可静脉输注等，同时还具有舒张血管、抗血小板聚集、防止微循环堵塞、消炎止痛、抑菌等优点，使之成为研究首选。虽然5%-6%的二甲基亚砜冰冻保护剂无临床输注毒副作用，但其渗透性强、代谢物中有恶臭二甲基硫化物、致畸等原因，不能连续多次使用，因此在血小板冰冻保存中应该尽量减少其用量。

2 冰冻血小板的制备

孙瑜等研究认为75%DMSO的配制由DMSO原液与0.9%NaCl以3：1的体积比在无菌条件下配制，配好后置于-50℃冰箱保存，使用前取出，无需室温平衡。在百级无菌室内，以加药件按1ml/min的速度缓慢将DMSO原液加入血小板悬液深部，边加边振（频率60次/min），充分混匀，使终浓度为5%，振荡8min后-80℃冰冻保存。

3 冰冻血小板的最佳保存温度及保存时限

有研究表明，冰冻血小板储存温度越低，保存的时间就越长，效果越好。维持细胞生物活性、功能的最理想方法是程序降温，即深低温液氮（-179℃）冰冻保存，但由于该方法存在技术难度大，对设备要求高，需长期更换液氮，可能因偶然因素彻底损伤细胞等不利因素，不太适用于存量较大的血小板冻存。因此，深低温冰箱（-80℃）冻存是维持细胞生物活性、保留新鲜血小板生理功能较理想的方法之一。深低温冻存血小板的供给形式、数量保证和及时有效性等方面均优于其他方法，且操作方法简单容易，能极大地方便临床使用。

血小板于冰冻保存期间储存温度波动，会导致冰晶机械作用使血小板损伤。冰冻血小板随着贮存时间的延长，絮状物析出的情况有显著改变，原因可能是保存期间低温冰箱门被多次开启，导致温度波动。贮存时间越长，开启次数就越多，温度波动就越大，血小板损伤的概率和程度就越大。刘景汉认为，冰冻血小板在-80℃以下保存可达6-12个月，解冻后血小板聚集功能恢复良好，临床使用效果理想。但在实际工作中，低温冰箱门的反复开启是不可避免的，因此建议保存期在6个月较适宜。

冰冻血小板复融温度和时间也有明确规定，黄彦等认为，血小板复融温度为37-40℃，快速复温应在两三分钟内完成。在天气寒冷的冬天或者周围环境温度较低时，融化时间应适当延长，但融化时间不宜超过5分钟。

尽管冰冻血小板在制备、保存和融解等过程中，血小部分被破坏，数量有所减少，但仍具有相对完整的超微结构和较高的回收率。冰冻血小板在复融后越早输注止血效果越好，应嘱临床立即用经滤血器快速輸注，如需保存也最好置于22℃环境中，保存时间不宜过长，建议尽可能在解冻后2小时内输完。二甲基亚砜对细胞的毒性作用在室温中比低温时大，因此应尽量缩短在室温中的停放时间，以减少二甲基亚砜的毒性反应。

4 冰冻血小板的功能检查

判断冰冻血小板的输注效果主要通过检测其体外功能和体内功能来判断，体外检测方法多样，比如，血小板的聚集功能、血块收缩试验、粘附功能、分泌功能、膜表面促凝血活性的功能等，体内功能主要通过检测其数量的变化、出血情况的改善、血小板回收率及输血疗效等。

有相关研究表明，冰冻血小板在贮存到取用的过程中，将会损失超过25%的血小板。因此，新鲜液态血小板在血小板计数提升方面有明显的优势。但是，陈兴智认为血小板体外功能实验不能正确反映冰冻血小板的体内止血功能，尤其是对出血倾向的内科患者或外科渗血的患者，血小板计数或CCI值并未明显升高，但是患者出血点消失，病灶出血减少或明显好转也说明是有效的。

研究发现，与新鲜血小板比较，冰冻保存血小板产生了与冰冻前显著不同的新亚群。冰冻后血小板中的CD62p阴性和CD62p阳性的血小板结合因子V的能力都显著提高，特别是占低温保存血小板总数50%的GPIb减少亚群结合V因子的能力比新鲜液体血小板高出多达5倍以上，促凝血活性明显增强，低温保存血小板的止血效果强于新鲜液态保存3～4天的血小板^[25]。冰冻血小板膜表面黏附受体的结合能力明显增强，促凝血活酶明显提高，新的亚群的出现使得血小板对V因子的结合能力大大增强，CD62（ Pselectin）表达明显增高，使即刻止血效果显著。同时凝血酶激活的CD62p阴性亚群血小板在输入受血者体内，可在外周血正常存活，提高受血者外周血血小板水平。血小板通过低温保存后产生了新亚群，新亚群膜表面功能分子的变化与其体内存活率减少而即刻止血功能增强密切相关。冰冻血小板与新鲜血小板膜表面上亚群分子不同，部分冰冻血小板被激活，细胞膜表面血小板分子或受体发生改变或丢失，可能是冰冻血小板获得即刻止血功能明显增强特性的机理之一。

新鲜血小板由于血浆蛋白或其他抗原作用，输注新鲜血小板容易发生颜面部严重水肿输血反应，也可以发生过敏性休克。输注新鲜液态血小板发生过敏性荨麻疹的病例，改输冰冻血小板后解决了患者输血不良反应的同题，冰冻血小板输注后类似反应未见有报道，可能是抗原性较强的血浆蛋白等物质冷冻后抗原性减弱是冰冻保存血小板不发生类似反应的主要原因。

截止到目前，血小板的功能检测在临床上仍没有一个“金标准”，因为冰冻保存的血小板虽然出现形态改变及功能受损，但其输注到人体内仍能产生止血作用。制定一个血小板质量评价的最佳指标对于正确评价血小板制品的输注效果意义重大。

5 冰冻血小板的临床应用

血小板经深低温冰冻保存后，磷脂酰丝氨酸、CD62P等功能分子的表达、丢失和再分布，使其即刻止血效果功能明显增强：产生了新的亚群，使其促凝血活性明显提高，代谢基本停止，有害因子产生明显降低，因而输血反应率降低。细胞膜表面黏附受体的结合能力明显增强，使凝血活性明显提高，大量的血小板因子被释放出来，即刻止血效果显著。

研究发现，冰冻单采血小板外科病例有效率高于新鲜单采血小板，这主要与外科多用于妇产科、骨科、创伤大出血及手术出血等病例的止血治疗，冰冻单采血小板经冰冻保存后细胞膜表面粘附受体的结合能力增强促凝血活性提高，且活化的血小板及其裂解产物同样具有凝血、止血保护功能，即可止血效果显著有关，同时，也进一步印证了Antonio等认为冰冻血小板比新鲜血小板止血功能更有优势的观点。但冰冻单采血小板在内科病例的无效率高于外科病例（P<0.05），而新鲜单采血小板在这方面的差异却不具有统计学意义（P>0.05），这与内科多用于血液系统、肿瘤放化疗疾病等病例的预防性治疗，冰冻单采血小板复苏后容易被激活，在体内寿命缩短，而新鲜单采血小板提升外周血血小板计数比冷冻单采血小板显著有关。该类内科病例因反复多次输注出现免疫性血小板输注无效，应尽量采用HLA配合的新鲜单采血小板输注。

可见，冰冻血小板在临床应用中与新鲜血小板具有同等的有效性和安全性，可广泛用于临床，特别是在外科止血疗效上具有独特的优势。但对反复输注或血小板输注无效病例应优先选择新鲜血小板，以降低血小板输注无效和患者出血风险，提高临床疗效，有效保护血液资源。

6 存在问题

目前，血小板的冰冻保存研究还未取得突破性进展，-80℃的冰冻保存虽然延长了保存时间，血小板内的生物活性物质也受到保护，但其应用仍然受到很大地限制。如何降低低温贮存损伤，提高血小板的输注效果;怎样降低保护剂的毒性，增加血小板输注的安全性等等，这些问题一直存在，也是冰冻保存血小板研究的难点。冰冻保存后的血小板输注到人体内虽然存活时间较长，但与新鲜液态血小板仍有一定的差距，且二甲基亚砜的细胞毒性不能避免。如何能在保证血小板质量的情况下降低二甲基亚砜的浓度，增加输注的安全性，也是研究者们应该克服的一道难题。

深低温冰冻保存血小板从制备、保存、使用到质量检测等指标方面，目前均没有明确的国际或国家标准。因此，在实际应用中无统一的做法，一定程度上阻碍了冰冻血小板的推广使用。新颁布的《全血及成分血质量要求》（GB18469-2012）血液制剂方面并未提及冰冻血小板。血小板深低温保护剂二甲基亚砜具有渗透性强、代谢物二甲基硫化物有恶臭并有致畸等毒性作用，其在临床上的应用受到极大的限制。针对血小板深低温保存时所用保护剂二甲基亚砜的代谢产物有副作用的争议，中国国家食品药品监督管理局2007年指明二甲基亚砜可用于血小板、干细胞的低温保存和不经洗涤的临床输注。

7 展望

深低温冰冻保存血小板是长期大量保存血小板的有效方法。冰冻血小板的出现在很大程度上弥补了新鲜液态血小板在临床上供应不足的缺点，为临床提供了保障，也为很多患者赢得了时间，尤其是在骨髓干细胞移植、急危重症患者抢救、恶性肿瘤大剂量化疗等医学新技术的应用中发挥着重要的作用。同时，血小板具有非常重要的战略性地位，大的自然灾害、战争，都离不开血小板的及时、足量输注。因此，深低温冰冻血小板应作为国家重要的战略储配物资。

血液制品是一种具有生物活性的特殊药品。既是药品，必然具有副作用，即使有副作用，仍要用于临床。比如输血存在经血传播疾病的风险依然要输注;如紧急状况下允许少量○型红细胞的异型输注。药品如抗肿瘤的放化疗药，既杀死肿瘤细胞也杀死正常细胞，却依然要推广于临床。所以，笔者认为即使目前深低温冰冻血小板保护剂的选择等方面仍有不完善的地方，也应该允许按一定的比例制备冰冻血小板，如控制在血小板使用总量的15%以下，以新鲜液态血小板的替补角色存在。因为没有生命，就没有一切，生命权应该是排第一位的。因此，目前不应一刀切，而应允许少量的、限制性地使用5%-6%二甲基亚砜作为保护剂的深低温冰冻血小板，一边优化深低温冰冻保存血小板的制备方案。期待不久的将来，能有相关标准出台，将深低温冰冻保存血小板技术推广于临床，那将是一个里程碑式的改变。

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