摆倩文， 马石霞， 马咸莹， 丁功涛， 陈士恩

（1. 西北民族大学 生物医学研究中心中国- 马来西亚国家联合实验室， 甘肃 兰州 730030；2. 西北民族大学 生命科学与工程学院， 甘肃 兰州 730030）

马铃薯（Solanum tuberosum L.） ， 茄科茄属一年生草本， 又名土豆、 洋芋、 洋番薯等， 是世界上仅次于小麦、 水稻和玉米的第四大重要粮食作物[1]。2018 年我国马铃薯产量达1 798 万t， 其深加工产品主要是马铃薯淀粉、 马铃薯全粉和休闲食品， 每年约有400 万t 作为原料生产马铃薯淀粉[2]。 马铃薯淀粉加工会产生大量废水， 废水中蛋白含量较高。 目前， 这类马铃薯蛋白没有得到有效的回收利用， 而是作为工艺废水排放后进入生化处理池进行废水处理，如果将废水中的蛋白质进行回收并高值化利用， 马铃薯蛋白还能产生一定的经济效益， 同时能有效降低废水中的有机物含量， 为后续的污水处理降低难度[3-4]。

马铃薯蛋白作为马铃薯淀粉加工的副产物， 是一类高营养价值的天然高分子， 由19 种氨基酸组成， 必需氨基酸含量为20.13%， 占氨基酸总量的47.9%， 其中色氨酸含量32 mg/100 g， 赖氨酸含量高达93 mg/100 g， 远高于各类蛋白[5]。 其氨基酸组成均衡， 营养价值接近卵清蛋白， 具有重要的保健生理功能[6-7]。

以马铃薯蛋白为原料， 通过筛酶试验， 选择水解度最高的蛋白酶且以该水解条件进行酶解试验，为马铃薯蛋白进一步开发应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

马铃薯蛋白， 陕西斯诺特生物技术有限公司提供； 碱性蛋白酶、 中性蛋白酶、 木瓜蛋白酶、 复合蛋白酶、 风味蛋白酶， 山东隆科特酶制剂公司提供；氢氧化钠、 盐酸等， 均为分析纯； Gly-Gly-Tyr-Arg四肽标准品。

1.2 仪器

MS-H280-Pro 型数显加热磁力搅拌器， 北京开源国创科技有限公司产品； 水浴锅、 台式离心机、PB-10 型精密pH 计， Sartorius 公司产品； MP-500B型电子天平， 上海天平总厂产品； BIO-DL 型移液器， 上海沃元科技有限公司产品； 凯氏定氮仪， 丹麦福斯公司产品； 电泳仪， 美国BIO-RAD 产品； 高效液相色谱仪， 美国Agilent 产品； 紫外分光光度计，北京海鑫瑞科技有限公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 筛酶试验

配制8%的马铃薯蛋白质溶液， 调节pH 值至酶的最适pH 值， 按一定质量比分别加入蛋白酶， 在各酶最佳的温度条件下水解相同的时间， 计算并比较各酶的水解度， 筛选出水解度最高的酶。

5 种酶最佳反应条件见表1。

1.3.2 马铃薯蛋白水解物的制备

根据筛酶试验， 采用水解度最高的蛋白酶， 在温度55 ℃， pH 值7.5， E/S 1∶6， 反应时间4 h 的条件下进行水解。 将马铃薯蛋白粉溶解于纯水中，配制质量分数为8%， 调节最佳pH 值后按比例加入蛋白酶， 在适当温度下进行水解， 达到水解时间后将温度调至85 ℃， 水浴灭活蛋白酶15 min。 经离心超滤， 冻干保存。

1.3.3 马铃薯蛋白水解物的理化性质检测

（ 1） SDS-PAGE 凝胶电泳。 采用SDS-PAGE 凝胶电泳的方法分析马铃薯蛋白水解物的分子量大小。配制12%分离胶， 混合均匀加入玻璃板； 样品质量浓度按1 mg/mL 配制， 100 ℃下煮样变性10 min，上样量为20 μL。 80 V 电压下低温电泳2 h， 考马斯亮蓝染色之后脱色观察。

（ 2） 高效液相检测小分子量多肽。 色谱柱是Acquity Uplc Beh Sec 蛋 白 分 析 专 用 柱， 1.7 μm，4.6 mm×150 mm， 流动相为50 mmol/L K2HPO4和50 mmol/L KH2PO4， 流速0.3 mL/min， 于波长280 nm处测定分子量分布。

1.3.4 多肽含量的测定

取2.5 mL 样品加入2.5 mL 10%的三氯乙酸， 混匀， 静置10 min， 然后以转速4 000 r/min 离心15 min，取上清到50 mL 离心管， 并用5%三氯乙酸定容至刻度， 摇匀。 取0.6 mL 上述溶液置另一试管， 加入双缩脲试剂4 mL， 混匀， 静置10 min， 以转速2 000 r/min离心10 min， 取上清液于波长540nm 处测定OD 值，对照标准曲线求得样品中多肽质量浓度C（mg/mL） ，进而求得多肽含量。

2 结果与分析

2.1 筛酶结果

按5 种酶的最佳水解条件， 对马铃薯蛋白进行水解， 其中风味蛋白酶的水解度最高， 达29.98%，其次是复合蛋白酶， 达29.28%， 其余3 种酶水解度均低于20%。

不同蛋白酶的水解效果见图1。

酶与底物的结合具有特异性， 酶种类不同， 其水解效率也不同。 酶水解法是通过酶催化蛋白质分子中肽链（ 酰胺键） 断裂， 生成肽链长度较短的肽分子或游离氨基酸[8]， 酶水解法的酶解位点特定， 可以有选择性地水解某些蛋白一级结构特定的氨基酸肽键[9-10]。 水解度越高， 水解效果越好， 水解的肽段和氨基酸越多。 结合试验结果， 风味蛋白酶的水解度最高。 因此， 将风味蛋白酶选作为目标酶进行马铃薯蛋白水解。

2.2 分子量分布

2.2.1 SDS- PAGE 凝胶电泳

SDS-PAGE 凝胶电泳检测结果见图2。

图2 SDS-PAGE 凝胶电泳检测结果

由图2 可知， 将不同质量浓度的待测样品进行凝胶电泳， 马铃薯蛋白未水解之前， 蛋白分子量主条带分布在72， 34 kD 附近和大于17 kD 处， 经过充分酶解之后马铃薯蛋白水解被水解成多种小分子物质， 分子量分布在17～34 kD， 且在质量浓度为20 μg/mL 时蛋白条带较为明显。 因此， 马铃薯蛋白水解液中的马铃薯蛋白已被充分水解且分子量小于17 kD。 凝胶电泳结果表明风味蛋白酶酶解马铃薯蛋白效率较高。

2.2.2 高效液相

按1.3.4（2） 中所述色谱条件， 通过HPLC 检测分析马铃薯蛋白水解物中肽段分子量大小及所占百分比。

5 kD PH 高效液相色谱图谱见图3。

图3 5 kD PH 高效液相色谱图谱

由图3 可知， PH 共6 个洗脱峰， Peak1 保留时间5.18～5.213 min， 分子量大小为43 067 D， 所占百分比0.325%； Peak2 保留时间6.28～6.50 min， 分子量大小为6 691 D， 所占百分比23.152%； Peak3 保留时间6.50～7.24 min， 分子量大小为968 D， 所占百分比44.15%； Peak4 保留时间7.24～7.753 min， 分子量大小为79 D， 所占百分比7.304%； Peak5 保留时间7.753～8.953 min， 分子量大小为5 D， 所占百分比24.271%； Peak6 保留时间9.607～10.067 min， 分子量大小为1 D， 所占百分比0.798%。 其中， 分子量为968 D 的Peak2 组分是占比最高的组分。

5～10 kD PH 高效液相色谱图谱见图4。

由图4 可知， PH 共7 个洗脱峰， Peak1 保留时间4.493～5.180 min， 分子量大小为55 441 D， 所占百分比0.852%； Peak2 保留时间5.18～6.56 min， 分子量大小为6 579 D， 所占百分比43.066%； Peak3 保留时间6.56～6.96 min， 分子量大小为1 013 D， 所占百分比22.104%； Peak4 保留时间6.96～7.207 min，分子量大小为346 D， 所占百分比9.505%； Peak5 保留时间7.207～7.760 min， 分子量大小为105 D， 所占百分比9.308%； Peak6 保留时间7.760～9.380 min，分子量大小为5 D， 所占百分比22.328%； Peak7 保留时间9.380～10.260 min， 分子量大小为1 D， 所占百分比1.838%。 其中， 分子量为6 579 D 的Peak2组分是占比最高的组分。

10～30 kD PH 高效液相色谱图谱见图5。

图5 10～30 kD PH 高效液相色谱图谱

由图5 可知， PH 共6 个洗脱峰， Peak1 保留时间4.853～5.227 min， 分子量大小为40 074 D， 所占百分比0.716%； Peak2 保留时间5.227～6.527 min，分子量大小为8 172 D， 所占百分比33.288%； Peak3保留时间6.56～6.96 min， 分子量大小为893 D， 所占百分比42.383%； Peak4 保留时间6.527～7.260 min，分子量大小为76 D， 所占百分比5.315%； Peak5 保留时间7.260～7.773 min， 分子量大小为105 D， 所占百分比9.308%； Peak6 保留时间7.773～8.62 min， 分子量大小为5 D， 所占百分比16.492%； Peak7 保留时间9.393～10.087 min， 分子量大小为1 D， 所占百分比1.807%。 其中， 分子量为893 D 的Peak3 组分是占比最高的组分。

30 kD PH 高效液相色谱图谱见图6。

图6 30 kD PH 高效液相色谱图谱

由图6 可知， PH 共6 个洗脱峰， Peak1 保留时间4.493～5.073 min， 分子量大小为62 257 D， 所占百分比0.292%； Peak2 保留时间5.073～6.460 min，分子量大小为7 450 D， 所占百分比21.609%； Peak3保留时间6.460～7.247min， 分子量大小为990 D， 所占百分比49.561%； Peak4 保留时间6.527～7.260 min，分子量大小为76 D， 所占百分比5.315%； Peak5 保留时间7.260～7.747 min， 分子量大小为80 D， 所占百分比6.466%； Peak6 保留时间9.573～10.173 min，分子量大小为1 D， 所占百分比0.766%。 其中， 分子量为990 D 的Peak3 组分是占比最高的组分。

综上所述， 马铃薯蛋白经风味蛋白酶水解后得到的水解产物中， 不同分子量大小的组分中， 小分子物质所占百分比大， 由于经过蛋白酶的充分酶解，大分子物质含量较少。

2.3 多肽含量

2.3.1 标准曲线的制作

取10 个15 mL 离心管， 用5% 的TCA 依次配制0， 0.2， 0.4， 0.6， 0.8， 1.0， 1.2， 1.4， 1.6， 1.8 mg/mL的Gly-Gly-Tyr-Arg 四肽标准溶液， 然后分别取6.0 mL 标准溶液， 加入4.0 mL 双缩脲试剂， 于漩涡混合仪上混合均匀， 静置10 min， 以转速2 000 r/min离心10 min， 取上清液于波长540 nm 处测定OD 值（ 以第一管做空白对照）[11]。 以肽的质量浓度为横坐标X， OD 值为纵坐标Y， 制作标准曲线， 得到回归方程Y=0.048 1X-0.004 7， R2=0.990 4。

Gly-Gly-Tyr-Arg 四肽标准曲线见图7。

图7 Gly-Gly-Tyr-Arg 四肽标准曲线

2.3.2 马铃薯蛋白水解物中的多肽含量

比较蛋白水解物多肽分布情况见表2。

表2 比较蛋白水解物多肽分布情况

有研究报道[12-13]， 酪蛋白通过碱性蛋白酶水解后的产物中以1～5 kD 的肽段为主， 占83.5%±5.1%；小于1 kD 的占74%±5.5%； 大于5 kD 的只有16.7%±1.6%。

由表2 可知， 马铃薯蛋白和酪蛋白多肽含量相近。 马铃薯蛋白水解物中谷氨酸含量高达13.74%，是酪蛋白的3～11 倍， 谷氨酸参与蛋白质[14]， 多肽及脂肪酸的合成， 在细胞生长代谢其重要作用， 其中多肽又是蛋白质水解的中间产物， 且是经过水解之后得到的水解物中不含有大分子量的蛋白质， 均在10 kD左右。 马铃薯蛋白经过酶解， 得到的分子量均小于10 kD， 说明该蛋白的酶解产物主要为小分子肽类。

3 结论

以马铃薯蛋白为原料（83.7%） ， 选用风味蛋白酶进行水解， 比较了中性蛋白酶、 碱性蛋白酶、 木瓜蛋白酶、 风味蛋白酶和复合蛋白酶酶解之后的水解度， 选择风味蛋白酶作为目标酶进行水解， 研究了其水解条件得到的水解产物的理化性质。 通过分子量分布与多肽含量分析， 得到马铃薯蛋白水解物分子量大小基本小于5～10 kD， 在小于5 kD 的多肽中， 占比最高的组分分子量为986 D， 占比44.15%；5～10 kD 中分子量占比最高的组分分子量为6 579 D，占比43.06%。 说明马铃薯蛋白经过充分酶解， 得到的酶解产物中大分子物质含量较少， 大部分为小分子肽段， 表明水解效果较好， 基于该水解条件的工艺方法有效可行。