张爱梅,殷一然,孔维宝,朱学泰,孙 坤

西北师范大学生命科学学院, 兰州 730070

非豆科植物西藏沙棘(Hippophaetibetana)是一种典型的放线菌结瘤植物[1],其根部也能形成根瘤,西藏沙棘的根瘤在形态结构和发育特点方面均与豆科植物和根瘤菌形成的根瘤不同[2-3],西藏沙棘根瘤内的共生微生物主要是能够固氮的放线菌弗兰克氏菌(Frankiaspp.)。对于沙棘属植物根瘤内弗兰克氏菌的研究,早在1982年Burggraaf等[4]就从沙棘根瘤中分离到弗兰克氏菌的纯培养物,之后研究者也对沙棘根瘤内生弗兰克氏菌进行了分离培养[5-6]、生理生化特征分析[7]、分子特性[8]以及不同生境及不同寄主植物来源多样性[7-8]等方面的研究。对沙棘属植物不同种类来说,国内外也有学者开展了对柳叶沙棘[9]、蒙古沙棘[10]、中国沙棘[8, 11]、大果沙棘[12]等的弗兰克氏菌的相关研究工作,研究内容涉及沙棘弗兰克氏菌形态观察、结瘤机理、分离回接等[1, 13]。所有这些研究大都是基于要从沙棘属植物中分离得到弗兰克氏菌的纯培养而开展的相关工作,在这些研究中,对弗兰克氏菌多样性研究,是研究者关注的一个热点,但由于弗兰克氏菌离体培养的难度较大,实验室条件下提供的培养基及培养环境与弗兰克氏菌所处的自然环境之间存在很大差异,大量弗兰克氏菌无法通过纯培养获得目标菌株[14-15]；加之其分离培养周期长、成功率低,大部分寄主植物的弗兰克氏菌仍未分离得到纯培养,分离到的菌株数量也极有限,使得弗兰克氏菌的多样性及其他应用研究进展缓慢[16]。

随着高通量测序技术的发展,对弗兰克氏菌多样性的研究提供了更多便利。高通量测序等免培养分子生物学技术不仅能够检测到植物组织中相对丰度较低、难培养的内生微生物,且能为植物内生菌群落多样性、相对丰度和稀有微生物信息提供更可靠且更全面的信息[17-18]。本课题组前期通过高通量测序发现,中国沙棘根瘤中除了弗兰克氏菌外,还存在着内生非弗兰克氏菌,且这些内生菌在同一寄主植物中还具有丰富的多样性[19-20]。并且,高通量测序中,对沙棘属植物弗兰克氏菌的物种多样性分子数据库也缺乏足够的不同来源寄主的数据,分析过程中没有明确的划分种水平操作分类单元(Operational taxonomic unit, OTU)的参考值。因此,本研究通过采用16S rRNA基因扩增子高通量测序技术,从门水平、属水平和OTU水平剖析西藏沙棘根瘤内生弗兰克氏菌和非弗兰克氏菌的多样性,以期为同一寄主植物中弗兰克氏菌多样性的研究提供思路。

1 研究方法

1.1 样地信息及样品采集

采样地位于甘肃省天祝县抓喜秀龙乡金强河地区,经纬度为37°28′N,104°09′E,全区海拔在2900—4300 m之间,地处北祁连山东段。气候寒冷潮湿,年均气温-2 ℃,年降水量560 mm,年蒸发量1592 mm,无绝对无霜期,仅分冷暖两季,属寒冷、干旱、半干旱高原性气候[21]。于2018年9月21日在位于天祝县金强河河滩地的西藏沙棘灌丛典型生境中,选取6株西藏沙棘植株,挖取其根瘤部分,并装入无菌袋中进行保存。西藏沙棘的根瘤形态如图1所示,西藏沙棘根瘤所处土壤环境的pH为7.33±0.12,含水量为(26.47±0.34)%。

图1 西藏沙棘的根瘤形态Fig.1 Nodules morphology of Hippophae tibetana

1.2 西藏沙棘根瘤总DNA的提取、PCR扩增及高通量测序

根瘤内生菌总DNA的提取采用CTAB法并稍作修改[22-23],并用1%琼脂糖凝胶电泳检测所提取DNA的质量。使用带Barcode的特异引物对总DNA的16S rRNA-V4区进行PCR扩增。PCR扩增采用50 μL PCR扩增体系,扩增反应条件为98 ℃预变性5 min,98 ℃变性30 s,50 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,25个循环,最后72 ℃延伸5 min。PCR产物于2%琼脂凝胶电泳检测,剩余样品4 ℃保存备用[24-25]。使用Thermofisher公司的Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns 建库试剂盒进行文库的构建,构建好的文库经过Qubit 定量和文库检测合格后,使用Illumina Hiseq最长测序平台进行上机测序。高通量测序过程由北京诺禾致源生物信息科技有限公司完成。

1.3 高通量测序数据处理与分析

使用Cutadapt(V1.9.1, http://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/)[26]先对Reads进行低质量部分剪切,再根据Barcode从得到的Reads中拆分出各样品数据,截去Barcode和引物序列初步质控得到原始数据经过以上处理后得到的Reads需要进行去除嵌合体序列的处理,Reads序列通过(https://github.com/torognes/vsearch/)[27]与物种注释数据库进行比对检测嵌合体序列,并最终去除其中的嵌合体序列,得到最终的有效数据。利用Uparse软件(Uparse v7.0.1001,http://www.drive5.com/uparse/)[28]对所有样品的全部有效数据进行聚类,默认以97%的一致性将序列聚类成为不同的可操作分类单元,同时会选取OTUs中出现频数最高的序列作为OTUs的代表序列。对OTUs序列进行物种注释,用Mothur方法与SILVA132(http://www.arb-silva.de/)[29]的SSUrRNA数据库[30]进行物种注释分析,获得分类学信息并分别在各样本的各个分类水平统计群落组成。

2 结果与分析

2.1 根瘤内生菌的群落组成

高通量测序共得到根瘤内生菌原始序列71858条,有效序列68265条,优质序列43219条,样品测序覆盖度为99.2%,测序深度达到分析要求且数据质量可靠。基于97%相似度的分类水平,共注释到826个细菌OTU,分属于22个门、33个纲、69个目、113个科和203个属。相对丰度排名前10的门和属如表1所示,结果表明,在门分类单元,西藏沙棘根瘤内生菌主要分布在放线菌门(Actinobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)等,其中优势门为放线菌门(Actinobacteria)。从属水平来看,西藏沙棘根瘤内生菌主要分布在弗兰克氏菌属(Frankia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)等,优势属为弗兰克氏菌属(Frankia)。

表1 西藏沙棘根瘤内生菌相对丰度Table 1 Relative abundances of endophytes associated with H. tibetana root nodules

对丰度排名前10的属进行物种分类树绘制,结果如图2所示。以上结果均表明,在沙棘根瘤内生菌中,不仅存在着大量的弗兰克氏菌,还存在着非弗兰克氏菌。

图2 西藏沙棘根瘤内生菌物种分类树状图Fig.2 Classification tree of endophytes associated with H. tibetana root nodulesMonera: 原核生物界; Actinobacteria: 放线菌门; Oxyphotobacteria: 生氧光细菌门; Proteobacteria: 变形菌门; Frankia: 弗兰克氏菌属; Kineococcus: 动球菌属; Frondihabitans: 叶居菌属; Friedmanniella: 弗莱德门氏菌属; Unidentified Oxyphotobacteria: 未鉴定-生氧光细菌; Methylobacterium: 甲基杆菌属; Sphingomonas: 鞘氨醇单胞菌属; Pseudomonas: 假单胞菌属; Stenotrophomonas: 寡养单胞菌属; Massilia: 马赛菌属

2.2 土壤pH及含水量对西藏沙棘根瘤内生菌群落组成的影响

将西藏沙棘根瘤内生菌群落中优势属与土壤pH及含水量(Water content, WC)进行RDA分析,并使用Canoco 5进行结果可视化,结果如图3所示。

图3 西藏沙棘根瘤内生菌优势属相对丰度与土壤pH及含水量的RDA分析Fig.3 RDA analysis of relative abundances of dominant genera in H. tibetana root nodules with soil pH and water content RDA: 冗余分析 Redundancy Analysis; WC: 含水量 Water Content

RDA分析结果表明,排序轴RDA1和RDA2方差变量解释分别为97.93%和2.07%；其中,弗兰克氏菌属和未鉴定-生氧光细菌的相对丰度与土壤pH及含水量的变化呈正相关,其余优势属的相对丰度则与土壤pH及含水量的变化呈负相关。

2.3 根瘤内生弗兰克氏菌的多样性

在西藏沙棘的根瘤内生菌中,弗兰克氏菌为优势属。通过高通量测序技术检测到西藏沙棘根瘤样本中共含有7个弗兰克氏菌属的OTUs,选择弗兰克氏菌属每个OTU的代表序列,与NCBI中已发表的39条弗兰克氏菌属16S rRNA基因序列进行比对,以与弗兰克氏菌属亲缘关系最近的Acidothermuscellulolyticus作为外类群[31],构建系统发育树,结果如图4所示。

图4 西藏沙棘根瘤内生弗兰克氏菌系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree of Frankia species associated with H. tibetana root nodules 基于邻接法, 节点上的数值为步长值(Bootstrap), 低于50%的数值(1000次重复)没有显示,括号内为含有NCBI中已发表弗兰克氏菌16S rRNA基因的序列登录号

图4结果表明,高通量测序检测到的弗兰克氏菌OTU与来自欧洲、美洲、非洲、亚洲和大洋洲的鼠李科、胡颓子科、马桑科、蔷薇科、杨梅科、木麻黄科及桦木科等放线菌结瘤植物根瘤的弗兰克氏菌被分为4个明显的类群,包括未获得纯培养的根瘤弗兰克氏菌(Clade I, unisolated strains),赤杨-杨梅-木麻黄侵染组的弗兰克氏菌(Clade II, Alnus-Myrica-Casuarina infective strains),胡颓子科侵染组的弗兰克氏菌(Clade III, Elaeagnaceae infective strains)及非典型菌株(Clade IV, Atypical strains)。OTU3和OTU241属于胡颓子科侵染组的弗兰克氏菌(Clade III),其中OTU3与Nouioui等[32]鉴定的Frankiaelaeagni相似度较高,而OTU241未能精确鉴定到种；OTU88、OTU1030、OTU1958、OTU1524和OTU2669属于赤杨-杨梅-木麻黄侵染组的弗兰克氏菌(Clade II),其中OTU88与Nouioui等[32]鉴定的Frankiaalni相似度较高,而OTU1030、OTU1958、OTU1524和OTU2669未能精确鉴定到种。

统计弗兰克氏菌每个OTU代表序列的比对结果、OTU的序列数及其相对丰度,结果如表2所示。结果表明,各个弗兰克氏菌的OTU在西藏沙棘根瘤中的丰度不同。

表2 西藏沙棘根瘤内生弗兰克氏菌OTUs序列数及其代表序列分类鉴定Table 2 Sequences number of Frankia OTUs representative sequences associated with H. tibetana root nodules

以上结果均表明,在西藏沙棘根瘤中,存在着大量未被鉴定的弗兰克氏菌,因此后续实验可对西藏沙棘根瘤中的弗兰克氏菌进行富集培养,并通过形态鉴定、生理生化和分子方法进行鉴定。

2.4 根瘤内生非弗兰克氏菌的多样性

在西藏沙棘的根瘤中,除了共生固氮的弗兰克氏菌外,还存在着丰富的非弗兰克氏菌。通过高通量测序发现,在非弗兰克氏菌群中,优势属为假单胞菌属(Pseudomonas),相对丰度为4.45%。除弗兰克氏菌外,选择相对丰度排名前9的西藏沙棘根瘤内生非弗兰克氏菌的OTU的代表序列,构建系统发育树,结果如图5所示。结果表明,在相对丰度前9的西藏沙棘根瘤内生非弗兰克氏菌中,鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)共含有10个不同的OTUs,表明其具有较高的多样性；此外,甲基杆菌属(Methylobacterium)含有4个不同的OTUs,马赛菌属(Massilia)含有3个不同的OTUs,假单胞菌属(Pseudomonas)、未鉴定的生氧光细菌(unidentified Oxyphotobacteria)各含有2个不同的OTUs,寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、动球菌属(Kineococcus)和弗兰德门氏菌属(Friedmanniella)在西藏沙棘的根瘤中仅被检测到1个OTU。

图5 西藏沙棘根瘤内生非弗兰克氏菌系统发育树Fig.5 Phylogenetic tree of non-Frankia endophytes associated with H. tibetana root nodulesunidentified Oxyphotobacteria: 未鉴定-生氧光细菌; Kineococcus: 动球菌属; Frondihabitans: 叶居菌属; Friedmanniella: 弗莱德门氏菌属; Pseudomonas: 假单胞菌属; Stenotrophomonas: 寡养单胞菌属; Massilia: 马赛菌属; Methylobacterium: 甲基杆菌属; Sphingomonas: 鞘氨醇单胞菌属

对每个OTU的代表序列在NCBI里进行BLAST比对,对其进行分类鉴定,并统计其在西藏沙棘根瘤中的序列数,结果如表3所示。结果表明,不同的非弗兰克氏菌在西藏沙棘根瘤中的丰度不同；此外,属于未鉴定的生氧光细菌中的OTU2和OTU13代表序列经NCBI中的BLAST比对后,无法精确鉴定到种。表3和图5的结果均表明,西藏沙棘根瘤的内生非弗兰克氏菌存在着丰富的物种多样性。

表3 西藏沙棘根瘤内生非弗兰克氏菌OTUs序列数及代表序列分类鉴定Table 3 Sequences number of non-Frankia OTUs and identification of their representative sequences associated with H. tibetana root nodules

3 讨论

本研究采用16S rRNA基因扩增子高通量测序技术,对生长于天祝县抓喜秀龙乡金强河地区的西藏沙棘根瘤内生菌多样性进行了研究。研究结果表明,西藏沙棘根瘤内生菌具有丰富的多样性,不仅包含人们研究较多的能够共生固氮的弗兰克氏菌,还包含其他非弗兰克氏菌。高通量测序方法检测结果还表明,弗兰克氏菌属是西藏沙棘根瘤内生菌中的绝对优势菌,其相对丰度高达47.63%。樊梦颖[33]采用高通量测序技术对沙棘属植物中的中国沙棘根瘤内生细菌群落也进行过研究,发现中国沙棘根瘤细菌群落是极其丰富和多样的,在根瘤中既有多种类型的放线菌也有多种类型的非放线菌,但均以弗兰克氏菌属细菌占绝对优势。可见,不同沙棘属植物根瘤内生菌中,弗兰克氏菌属均是优势属,其也是根瘤能够固氮的主要贡献者。

本研究在利用高通量测序对西藏沙棘根瘤内生菌多样性进行分子鉴定时,对测序所得的序列进行相关序列分析,以OTU作为参考,在不同分类水平上对每一条序列进行划分归类[34],可将相似度大于97%的序列归属于相同物种,即分子种(phylotype)[35]。本研究通过高通量测序检测到西藏沙棘根瘤中共含有7个属于弗兰克氏菌属的OTUs,通过分析比对被归属于弗兰克氏菌属7个OTUs的16S rRNA序列,发现在西藏沙棘根瘤中,存在着和已发表序列相似度较高的序列,也存在着未能和已发表序列进行聚类的新种序列。因此,对于在西藏沙棘根瘤中检测到的弗兰克氏菌,后续还可结合纯培养技术对分离获得的菌株进行形态鉴定、生理生化鉴定和分子鉴定,以确定其是否为新种。张明明[36]采用相同方法,对中国沙棘根瘤弗兰克氏菌属的OTUs进行过分析,检测到只有2个属于弗兰克氏菌属的OTUs,可见,位于高寒地区的西藏沙棘根瘤内相对于其他沙棘属植物根瘤可能含有更为丰富的弗兰克氏菌资源。

对于沙棘属植物根瘤内弗兰克氏菌多样性的研究,已有学者采用不同的方法进行过相关研究,陈立红等[10]利用PCR-RFLP分子标记方法,对不同样地分布的中国沙棘根瘤内的弗兰克氏菌的遗传多样性研究发现,中国沙棘根瘤中的弗兰克氏菌在多数地点至少有2种不同基因型,且中国沙棘根瘤共生弗兰克氏菌具有丰富的遗传多样性,在不同采样点沙棘根瘤内弗兰克氏菌遗传多样性的丰富度不一样。徐瑞瑞[8]采用了从根瘤内直接扩增DNA的技术,通过16S rRNA全长序列分析,研究了内蒙磴口和黑龙江孙吴沙棘根瘤弗兰克氏菌的系统发育关系,发现在根瘤共生体中,除了共生的弗兰克氏菌外,还广泛存在着非弗兰克氏放线菌,且鉴定沙棘根瘤中直接扩增的弗兰克氏菌,隶属于胡颓子侵染组。本研究通过构建系统发育树也发现,西藏沙棘根瘤中的部分弗兰克氏菌不仅可以侵染胡颓子科(Elaeagnaceae)沙棘属(Hippophae)的西藏沙棘,还能够侵染桦木科(Betulaceae)桤木属(Alnus)的赤杨(Alnusjaponica)及木麻黄科(Casuarinaceae)木麻黄属(Casuarina)的木麻黄(Casuarinaequisetifolia)等非豆科植物,表明西藏沙棘根瘤中的某些弗兰克氏菌株具有寄主植物的多样性。

本研究还发现,西藏沙棘根瘤中的非弗兰克氏内生菌主要有假单胞菌属和鞘氨醇单胞菌属等。其中,假单胞菌属为本研究中检测到的相对丰度仅次于弗兰克氏菌属的优势属,其相对丰度为4.45%,包含2个OTUs。假单胞菌属细菌能够广泛分布于各种类型的生境中,包括在植物的根瘤内[37]。徐瑞瑞[8]采用根瘤匀浆法和根瘤切片法,对沙棘根瘤内生菌进行了纯培养,得到18株非弗兰克氏放线菌,分别属于诺卡氏菌属和小单孢菌属。可见,采用的研究方法不同,沙棘属植物根瘤内的非弗兰克氏放线菌的优势属也存在一定的差异；这主要与纯培养时采用的培养基与方法和内生菌生存的自然生态环境之间的差异有关。有研究表明,假单胞菌是宿主植物根内主要的促生菌群[17,38]。但目前关于弗兰克氏菌和假单胞菌等非根瘤菌之间的相互作用,以及假单胞菌与西藏沙棘的互作关系仍有待于深入的探究。而在根瘤中的鞘氨醇单胞菌属,具有10个OTUs,表明其在西藏沙棘根瘤内具有最为丰富的物种多样性。因此,为了探明西藏沙棘根瘤内生菌的多样性,仍需要开展进一步的研究,将高通量测序等免培养分子生物学技术与纯培养方法相结合,并对内生菌之间的相互作用进行探究及验证,不仅能够丰富西藏沙棘根瘤内生菌菌种资源,还能够为西藏沙棘适应高寒特殊生境的机制提供理论依据。