刘园园赵心明杨珍李雪郭若曦

(1.天津城市职业学院，天津 300250；2.天津中医药大学，天津 301617；3.天津医科大学总医院，天津 300052；4.天津尚美化妆品有限公司，天津 300385)

皮肤是人体最外层组织，具有屏障作用，可以抵御包括紫外线在内的外部不良因素对人体的损伤。人体适量接受紫外线的照射有助于人体健康，但急性过量紫外线照射可损伤皮肤及皮肤屏障，出现红斑、水肿、水疱、炎症性疼痛等急性光损伤表现[1]。随着人们对皮肤老化研究逐渐深入，越来越多的学者关注UVB引起的皮肤急性光损伤，而对于该病的防治许多具有生物学活性的植物提取物已被报道[2-4]。

肉苁蓉是我国的传统药食两用的药物，被列为九大仙草之一，素有“沙漠人参”的美誉[5]。主要含有苯乙醇苷类、环烯醚萜及其苷类、木脂素及其苷类、多糖等，具有广泛的生物活性[6]。其中肉苁蓉多糖具有调节免疫活性、抗衰老、改善学习记忆能力、保护神经、抗肝损伤、抗病毒、抗肿瘤、影响肠道菌群等诸多药理作用[7]。但未见其对UVB引起的皮肤急性光损伤的保护研究。故本研究将细胞实验与动物实验相结合，研究肉苁蓉多糖对皮肤急性光损伤的保护作用。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

乙醇(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)，4%组织固定液(北京索莱宝科技有限公司)，超氧化物歧化酶(SOD)活性检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，货号：BC0175)，丙二醛(MDA)含量检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，货号：BC0025)，四甲基偶氮唑蓝(MTT)试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，货号：M1020),二甲基亚砜DMSO(北京索莱宝科技有限公司，货号：D8371)。肉苁蓉经天津中医药大学马琳教授鉴定为管花肉苁蓉(Cistanche tubulosa)。

电热套(山东鄄城华鲁电热仪器有限公司)，旋转蒸发仪(瑞士步琦公司)，SH4型紫外线光疗仪(上海希格玛高技术有限公司)，MULTISKAN GO酶标仪(赛默飞世尔科技公司)，皮肤水分含量测试仪(德国CK公司)，BDS200型倒置光学生物显微镜(重庆奥特光学仪器公司)。

ICR小鼠，体质量18～22g，购于斯贝福(北京)生物技术有限公司，合格证号为SCXK(京)2019-0010。

1.2 实验方法

1.2.1 肉苁蓉多糖的制备[8]

取40g肉苁蓉粗粉，用120mL 95%的乙醇回流提取2h，去除色素和脂溶性杂质，取滤渣挥干溶剂后，加入15倍量的水，95℃水浴提取2次，每次3h，合并提取液，旋转蒸发仪浓缩至浓度分别为80mg·mL-1和320mg·mL-1，4℃保存，备用。

1.2.2 肉苁蓉多糖对HaCaT细胞存活率的影响[9]

实验分为对照组、UVB组和肉苁蓉多糖加UVB组，将HaCaT细胞接种于96孔板，贴壁后，正常组不进行处理，模型组、肉苁蓉多糖加UVB组均分别以30mJ·cm-2和60mJ·cm-2的UVB进行照射，照射完毕后，给药组分别给予20mg·mL-1、50mg·mL-1、80mg·mL-1的肉苁蓉多糖，培养24h，弃去上清液，用PBS清洗一遍，每孔加入100μL含有10%MTT的培养液，继续培养4h，弃去上清液，每孔加入100μL DMSO溶液，放入酶标仪振摇1min，使结晶物充分溶解，在492nm处测定各孔的吸光度，记录结果。

式中，AOD值为对照组对应的OD值；BOD值为UVB组、肉苁蓉多糖加UVB组对应的OD值。

1.2.3 急性光损伤模型的建立及用药[10]

ICR小鼠适应性饲养7d，按体重质量随机分为空白组，模型组，肉苁蓉多糖高(320mg·mL-1)、低剂量组(80mg·mL-1)，每组6只。实验开始前，去除小鼠背部毛发(面积约为3cm×3cm)。取0.25mL肉苁蓉多糖均匀涂抹于小鼠背部脱毛区域，空白组和模型组以等体积的生理盐水涂抹，30min后用300mJ·cm-2的UVB照射背部脱毛区域，连续照射3d，于最后一天照射结束后，活体情况下测定小鼠皮肤含水量，处死小鼠，分别取血液和脱毛部的皮肤组织，进行后续实验。

1.2.4 皮肤含水量测定[11]

在室温为20～25℃，空气相对湿度为50%～60%的环境下，使用皮肤水分含量测试仪对空白组，模型组，肉苁蓉多糖高、低剂量组ICR小鼠进行皮肤含水量测试，选取小鼠背部脱毛区域对每只小鼠测量3次，记录数据，取平均值。

1.2.5 HE染色

取约1cm2的皮肤组织固定于4%的组织固定液中，常规石蜡包埋，连续切片，HE染色，光学显微镜观察。

1.2.6 皮肤组织中SOD活性及MDA含量测定

取皮肤组织按试剂盒说明书检测其中SOD活性及MDA含量。

1.2.7 血液中SOD活性及MDA含量测定

取小鼠血液于4℃冰箱静置1h后，4℃3000rpm离心15min，取上清按试剂盒说明书检测其中SOD活性及MDA含量。

1.2.8 数据分析

采用SPSS 26.0统计软件分析，数据用(Mean±s)表示，组间比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为差异极显著。

2 结果与讨论

2.1 肉苁蓉多糖对UVB照射HaCaT细胞的保护作用

肉苁蓉多糖对UVB照射HaCaT细胞的保护作用见图1。与对照组比较，不同辐照剂量的UVB对HaCaT细胞均具有显著的损伤作用(P<0.05)；与UVB(30mJ·cm-2、60mJ·cm-2)组相比，浓度为20mg·mL-1和50mg·mL-1肉苁蓉多糖，对不同辐照剂量UVB照射导致HaCaT细胞损伤具有显著的保护作用(P<0.05)，而浓度为80mg·mL-1肉苁蓉多糖，对不同辐照剂量UVB照射HaCaT细胞损伤的保护作用则没有显著性。

2.2 皮肤含水量变化

肉苁蓉多糖对急性光损伤小鼠皮肤含水量的影响结果见表1。模型组ICR小鼠皮肤含水量显著降低(P<0.05)。与模型组相比，肉苁蓉多糖高、低剂量组可以显著提高小鼠皮肤含水量(P<0.05)，肉苁蓉多糖高剂量组ICR小鼠皮肤含水量与空白组相比无显著性差异(P>0.05)。

表1 肉苁蓉多糖对急性光损伤小鼠皮肤皮肤含水量的影响(x±s，n=3)

2.3 组织切片HE染色结果

肉苁蓉多糖对急性光损伤小鼠皮肤组织的病理学影响结果见图2。空白组小鼠表皮层结构完整，有2～3层角质形成细胞，细胞分层清晰；真皮层可见波浪状纤维组织，排列有序，分布均匀，疏密有致，细胞成分及数量适中。与空白组相比，模型组小鼠表皮海绵水肿明显，个别细胞空泡变性，细胞分层不清；以淋巴细胞为主的单一核炎性细胞高度浸润，毛细血管扩张明显，表明急性光损伤模型造模成功。给药组小鼠表皮皮肤因光损伤所致组织病理改变程度较模型组减轻，表皮局灶性海绵水肿和炎症有所缓解，但尚未恢复到正常表皮状态。

图2 肉苁蓉多糖对急性光损伤小鼠皮肤组织的病理学影响(HE×200)

2.4 皮肤组织中SOD活性及MDA含量变化

肉苁蓉多糖对急性光损伤小鼠皮肤组织中SOD活性和MDA含量的影响结果见表2。与空白组相比，模型组ICR小鼠皮肤组织中SOD活性显著降低(P<0.05)；与模型组相比，肉苁蓉多糖高、低剂量组的SOD活性显著增加(P<0.05)，表明肉苁蓉多糖可有效抑制氧自由基的连续反应发生，提高皮肤组织的自御能力。与模型组相比，肉苁蓉多糖高、低剂量组的MDA含量有降低趋势(P>0.05)。

表2 肉苁蓉多糖对急性光损伤小鼠皮肤组织中SOD活性和MDA含量的影响(x±s，n=3)

2.5 血液中SOD活性及MDA含量变化

肉苁蓉多糖对急性光损伤小鼠血液中SOD活性和MDA含量的影响结果见表3。与空白组相比，模型组ICR小鼠血液中SOD活性显著降低(P<0.05)；与模型组比较，经肉苁蓉多糖干预后，急性光损伤ICR小鼠血液中SOD活性有升高趋势(P>0.05)，MDA含量有降低趋势(P>0.05)。

表3 肉苁蓉多糖对急性光损伤小鼠血液中SOD活性和MDA含量的影响(¯x±s，n=3)

3 讨论

肉苁蓉是药食两用的药物，其中肉苁蓉多糖是肉苁蓉的主要生物功能活性成分之一，本研究发现，UVB对HaCaT细胞具有损伤作用肉苁蓉多糖(20mg·mL-1、50mg·mL-1)对该损伤具有保护作用，而80mg·mL-1的肉苁蓉多糖对UVB照射的HaCaT细胞的存活率则没有保护作用，可能因为药物浓度过高，产生了一定的细胞毒性；肉苁蓉多糖可以显著提高皮肤组织中的SOD含量，说明肉苁蓉多糖具有清除ROS的作用，与其体外作用相一致[8]。而血液中SOD含量与模型组相比仅有上升趋势，是由于肉苁蓉多糖为水溶性成分，透皮吸收量不高，不能显著提高血液中SOD含量。对于靶部位在皮肤组织的疾病而言，能够提高皮肤组织中的SOD含量对疾病的治疗具有一定的意义；肉苁蓉多糖高剂量组皮肤含水几乎和正常组相当，除了肉苁蓉多糖具有较强的抗氧化作用，可以中和掉由UVB产生的自由基[8]，还可能是由于多糖本身具有一定的吸湿性[12]，可以维持皮肤一定的含水量；该研究中存在的不足主要是动物实验中UVB照射动物过程中，因UVB光线是漫反射和小鼠较难固定易移动，会导致不同位置的动物背部接收的紫外剂量不一致，会影响到实验数据。