阿 芸， 师尚礼， 李自立， 张晓燕， 欧克杰， 周文文

(甘肃农业大学草业学院， 草业生态系统教育部重点实验室， 中-美草地畜牧业可持续发展研究中心， 甘肃 兰州 730070)

‘清水’紫花苜蓿(MedicagosativaL.‘Qingshui’)是我国审定登记的第一个根茎型苜蓿品种，品种登记号为412，主要生长在甘肃省清水县和定西半阴湿的山脚地带。‘清水’苜蓿的根系是典型的根茎型，没有主根，全部为水平或斜生的根茎根，根茎上长出的芽发育成新株；它的茎一般为半平卧型生长，比直根型和根蘖型的茎纤细且耐践踏，是新型的优质放牧型牧草，但其产量较低[1-4]。目前，杂交育种是我国牧草育种中应用最普遍、成效最好的育种方法，其具有创新性，能够引起植物体遗传变异并表现出杂种优势，能更快地选育出符合育种目标，是大幅度提高苜蓿产量的一个重要途径[5-7]。有学者对杂交苜蓿各性状与其产量进行相关分析研究，发现株高、茎粗和分枝数等与其产量紧密相关[8-9]。

陈立强、师尚礼等[10-11]研究结果表明，甘肃清水县灌丛草原地带的野生紫花苜蓿与栽培品种间的亲缘关系较远，还通过SSR分子标记技术研究发现野生紫花苜蓿较栽培品种表现出了相对独立的遗传特性；张雪婷等[12]研究结果显示，陇东野生紫花苜蓿的核型为2B型，染色体较不对称，属较为进化的核型；南丽丽等[13-15]研究表明，根茎型‘清水’的抗寒性强于根蘖型‘甘农2号’和直根型‘陇东’，且其抗旱性中等。以上研究为‘清水’苜蓿杂交优势开发提供了依据。因此，本试验以‘清水’苜蓿与‘WL168’杂交后代选育系RSA-01，RSA-02和RSA-03为研究对象，于种植第5年对杂交材料的形态特征和生理特性进行观测分析，进一步了解其表型性状形态变异特征，并采用相关性和通径分析，了解其地上生物量与形态的关系，为后期提高根茎型苜蓿产量改良提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验于2020年在甘肃省兰州市甘肃农业大学牧草试验站进行，研究区位于兰州市西北部，地处黄土高原西端(105°41′ E，34°05′ N)，海拔1 525 m，属温带半干旱大陆性气候，年均气温9.7℃，平均年降水量451.6 mm，年蒸发量1 664 mm。试验地地势平坦，土壤类型为黄绵土，土层较薄，通气好。

1.2 试验材料

本研究以‘清水’紫花苜蓿与‘WL168’紫花苜蓿的杂交材料RSA-01，RSA-02和RSA-03及其亲本为试验材料。

2002年，研究团队在甘肃清水县灌丛草原地带发现了野生紫花苜蓿，挖取其单株移栽于甘肃农业大学兰州安宁牧草试验站进行分株繁殖和驯化栽培。2005年，选取茎枝较为直立、植株较高、叶量大、分枝多的根茎单株与直根型‘WL168’进行人工杂交，以根茎型根系和地上生物量为目标性状进行后代选育，2005年秋分株收获杂交种子。2006～2007年采用集团选择法进行选择，获得地上生物量较高的根茎枝条直立型紫花(RSA-01)单株12个，根茎枝条半平卧型紫花(RSA-02)单株10个，根茎枝条平卧型紫花(RSA-03)单株12株。2008～2010年，采用集团内混合选择法选择符合目标性状的株系组。2012～2013年按品系分别进行种植，进行品系群体内开放传粉、分系收种，获得杂交材料RSA-01，RSA-02和RSA-03，其株型特点如下。

RSA-01：茎枝与地面夹角70～80°、绝对株高较高、叶量较大。

RSA-02：茎枝与地面夹角30～69°、绝对株高较高、叶量较大。

RSA-03：茎枝与地面夹角30°以下、绝对株高较高、叶量大。

‘WL168’苜蓿购自北京正道生态科技有限公司，其它材料均由甘肃农业大学草业学院提供。

1.3 试验设计

前人研究表明，在半干旱地区，苜蓿生长最佳的利用年限为5～6年[16-17]，因此，本试验选取了种植第5年的苜蓿为研究对象，在第三茬初花期进行试验。2016年4月23日进行播种，采用随机区组设计，共5个处理(3个杂交材料、2个亲本材料)，每个处理3次重复，小区面积为3 m×5 m，行距为30 cm，播量为1 g·m-2。

1.4 指标测定及方法

1.4.1形态指标测定 地上生物量[18](t·hm-2)：每个小区随机选取1 m2样地，齐地刈割后称重，重复3次，取其平均值。

株高[18](cm)：每个小区随机测定10株，测量其绝对株高(地面至最高处垂直距离)，求其平均值。

茎粗[18](mm)：每个小区随机取10株，用游标卡尺测量选定单株主茎距地面5 cm处主茎的直径，求其平均值。

茎叶比[18]：每个小区取500 g鲜草，将茎叶分离后称重，放入105℃烘箱内杀青10 min，65℃烘干至恒重，计算茎叶比，重复3次，取其平均值。

叶长(cm)、叶宽(cm)和叶面积(cm2)[19]：每个小区随机取10株，用叶面积仪测定，求其平均值，叶片均取于第三叶位之三出复叶。

1.4.2生理指标测定 过氧化物酶(Peroxidase，POD)活性参考Chance等方法测定[20]。3 mL的反应体系包括：100 mM PBS(pH=6.0)，20 mM愈创木酚和40 mM H2O2。测定时，先将2.9 mL的反应混合液在25℃水浴中预热5 min，然后加入100 μL酶液启动反应，在470 nm波长下测定单位时间内吸光度值的变化。

超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)活性参考Giannopolitis等方法测定[21]，稍有改动。3 mL的反应体系包括：2.8 mL反应混合液[50 mM PBS(内含0.1 mM EDTA，13 mM甲硫氨酸和75 μM NBT，pH=7.8)]，100 μL酶液和100 μL核黄素溶液，于560 nm波长下测定吸光值。

过氧化氢酶(Catalase，CAT)活性采用稍作修改的Havir等的方法测定[22]。测定时，取2.9 mL的反应混合液(50 mM PBS，内含0.1 mM EDTA，pH=7.8)，加入50 μL酶液，在25℃下水浴中预热5 min，然后加入50 μL的19 mM H2O2启动反应，在240 nm波长下测定单位时间内吸光度值的变化。

1.5 数据处理与分析方法

式中X为测定指标具体数值，N为重复数,Xi第i个数据。

2 结果与分析

2.1 杂交材料的地上生物量

RSA-01，RSA-02地上生物量与‘清水’无显著差异，而RSA-03地上生物量比‘清水’高24.72%(P<0.05)。RSA-01和RSA-02地上生物量分别比‘WL168’低24.90%和18.30%(P<0.05)，而RSA-03地上生物量与‘WL168’差异不显著。

图1 ‘清水’苜蓿与‘WL168’杂交材料较亲本的地上生物量差异Fig.1 Above-ground biomass difference between the hybrid material of ‘Qingshui’ and ‘WL168’compared to their parents注：图中不同小写字母表示不同材料间差异显著(P<0.05)Note:Different lowercase letters in the figure indicate significant differences between different materials at the 0.05 level

2.2 杂交材料形态特征

RSA-01，RSA-02和RSA-03茎粗均显著高于‘清水’(P<0.05)(表1)；RSA-02，RSA-03茎粗均显著高于‘WL168’ (P<0.05)，而RSA-01与‘WL168’无显著性差异。RSA-02，RSA-03茎叶比均显著低于‘清水’，而RSA-01与‘清水’差异不显著；RSA-01，RSA-02和RSA-03茎叶比与‘WL168’均无显著性差异。5个处理的株高、叶长、叶宽和叶面积差异均不显著。

表1 ‘清水’苜蓿与‘WL168’杂交材料较亲本的形态特征差异Table 1 Differences in morphological characteristics between the hybrid materials of ‘Qingshui’alfalfa and ‘WL168’compared to their parents

由表2可知，杂交材料各表型性状变异丰富，其指标的变异系数大小顺序为：叶面积(10.91%)>茎叶比(9.47%)>株高(8.67%)>叶长(7.71%)>叶宽(7.61%)>茎粗(5.06%)，茎粗变异系数最小，说明茎粗表现最整齐。杂交材料茎粗变异系数低于亲本材料，两者茎粗范围分别为2.54～2.64 mm和2.19～2.50 mm。不同杂交材料茎粗变异系数大小顺序为：RSA-02(7.87%)>RSA-01(5.15%)>RSA-03(2.17%)，说明RSA-03表现最整齐。

表2 供试材料各形态指标的变异系数Table 2 Variation coefficient of each morphological index about all test materials

2.3 杂交材料生理特性

不同杂交材料的抗氧化酶(POD，SOD和CAT)活性与‘清水’和‘WL168’比较(表3)，RSA-01，RSA-02和RSA-03 POD活性均显著低于‘清水’(P<0.05)；RSA-01和RSA-03 POD活性均显著低于‘WL168’(P<0.05)，而RSA-02与‘WL168’差异不显著。RSA-01，RSA-03 SOD活性与‘清水’和‘WL168’均无显著性差异，而RSA-02显著低于‘清水’和‘WL168’。RSA-01，RSA-03与‘清水’的CAT活性差异均不显著，而RSA-02 CAT活性比‘清水’低54.86%(P<0.05)；RSA-01和RSA-02 CAT活性分别比‘WL168’低29.80%，61.71%(P<0.05)，而RSA-03 CAT活性与‘WL168’差异不显著。

表3 ‘清水’苜蓿与‘WL168’杂交材料较亲本生理特性差异Table 3 Differences in physiological characteristics between the hybrid materials of ‘Qingshui’ alfalfa and ‘WL168’compared to their parents

2.4 不同杂交材料地上生物量与形态指标的相关分析

如表4所示，RSA-01地上生物量与其形态指标的相关系数大小依次为：茎叶比>株高>茎粗>叶长>叶面积>叶宽，地上生物量与茎叶比呈极显著负相关关系(P<0.01)，与株高呈显著正相关关系(P<0.05)。RSA-02地上生物量与其形态指标的相关系数大小依次为：茎叶比>株高>茎粗>叶长>叶宽>叶面积，与茎叶比呈极显著负相关关系(P<0.01)，而与株高、茎粗分别呈极显著关系(P<0.01)和显著正相关关系(P<0.05)。RSA-03地上生物量与其形态指标的相关系数大小依次为：茎叶比>株高>叶面积>茎粗>叶长>叶宽，地上生物量与茎叶比呈极显著负相关关系(P<0.01)，与株高呈显著正相关关系(P<0.05)。

表4 不同杂交材料地上生物量与形态指标的相关性Table 4 Correlation between above-ground biomass and morphological indices of different hybrid materials

2.5 不同杂交材料形态指标对地上生物量的通径分析

地上生物量在一定程度上反映产量的高低，本研究在相关分析的基础上，通过通径分析，探讨RSA-01，RSA-02和RSA-03的各形态指标对其地上生物量的作用大小(表5)。

表5 不同杂交材料形态指标与地上生物量的通径分析Table 5 Path analysis of morphological indexes and above-ground biomass of different hybrid materials

RSA-01形态指标对其地上生物量的直接通径系数大小依次为：茎粗>茎叶比>叶长>株高>叶面积>叶宽，茎粗对其地上生物量的直接效应最大，其次是茎叶比。RSA-02形态指标对其地上生物量的直接作用大小依次为：茎叶比>茎粗>株高>叶宽>叶面积>叶长，茎叶比对其地上生物量的作用最大，其次是茎粗，而株高通过茎叶比对地上生物量的间接效应较大(I. E.= 0.682)。RSA-03形态指标对其地上生物量的直接通径系数大小依次为：茎叶比>株高>叶宽>叶长>叶面积>茎粗，茎叶比对其地上生物量的直接作用最大，而株高通过茎叶比对地上生物量的间接效应较大(I.E.=0.760)。

3 讨论

产量是苜蓿育种过程中的主要选育和评价的指标之一，而地上生物量在一定程度上反映产量的高低，其中，产量性状的形态指标包括了株高、茎粗、茎叶比和叶面积等[23-25]。变异系数是反映遗传变异占均值的大小，可以衡量不同变量的变异程度[26-27]，对杂交材料优势表现和潜力开发的研究具有重要的意义。本研究RSA-03地上生物量显著高于‘清水’，RSA-03茎粗显著高于‘WL168’和‘清水’，且其茎粗变异系数最小，为2.17%。所以，RSA-03的地上生物量、茎粗具有较强的杂种优势，且其茎粗表现最整齐，这为后期高产根茎型苜蓿材料的筛选奠定了理论基础。

植物体内的SOD，POD和CAT等是清除活性氧的清除剂，是抗氧化系统中的关键酶，对逆境非常敏感[28-29]。植物衰老程度越高，清除活性氧的能力越弱[30]。通常，通过植物地上部分的生长情况及抗逆性指标(SOD，CAT，POD活性和丙二醛含量)来直接或间接的反应植物对某环境的适应能力[30-31]。本研究中，RSA-01，RSA-03的POD活性显著低于两个亲本，RSA-02的POD活性显著低于‘清水’；RSA-02的SOD和CAT活性显著低于两个亲本，RSA-01的CAT活性显著低于‘WL168’，表明各杂交材料抗氧化酶活性的杂交优势值较亲本低，一方面说明了各杂交材料的衰老程度可能比双亲快，另一方面间接体现了杂交苜蓿对移栽环境适应能力较低，这可能与材料来源、选育、移栽和生长环境等有关[29-30]。

产量构成要素是决定豆科牧草生物量的重要因素，有学者对不同苜蓿材料形态特征与产量进行相关性研究，发现苜蓿株高、茎粗与其产量呈显著正相关关系[25,32-35]；张帆等[36]通过对紫花苜蓿杂交群体产量相关性状的遗传分析，发现株高、分枝数、茎叶比为干重主要构成因素，茎粗主要是通过间接作用影响干重。本研究应用相关分析，发现地上生物量与株高、茎叶比显著相关(P<0.05)，这与前人研究结果相似[31-34,36]。在此基础上，本研究通过通径分析表明，RSA-01，RSA-02和RSA-03茎叶比、茎粗与地上生物量的D.E.分别为-0.649和0.709，-0.700和0.422，-0.858和0.189。在其它形态指标相对稳定的情况下，茎叶比每减少一个标准单位，地上生物量就相应得到提高，而茎粗每增加一个标准单位时，地上生物量得到提高。茎叶比、茎粗是影响地上生物量的关键因素，而其它因素也是高产育种过程中不可忽视的重要因素[37]。

4 结论

与‘清水’相比，RSA-03的地上生物量和茎粗都具有显著的杂种优势，但其抗逆性减弱。通径分析表明，茎叶比、茎粗是影响地上生物量的关键因素。该结果为紫花苜蓿后期产量改良及抗逆性研究提供理论依据。