朱依晗， 刘宁芳， 胡龙兴， 徐 倩

(湖南农业大学农学院草业科学系， 湖南 长沙 410128)

我国盐碱地面积约有9 913万hm2，是我国重要的后备土地资源，改良和充分利用盐碱土对粮食生产和生态环境安全具有重要意义[1]。筛选和培育耐盐植物品种，是土壤盐碱化改良和利用的主要途径[2]，而对植物进行耐盐碱性评价，是植物耐盐碱育种和种质资源创新的基础[3]。

盐碱胁迫作为限制植物生长的重要环境因素，对植物从种子萌发到开花结实整个生长发育过程均有诸多影响，会造成植物发芽势和发芽率低、发芽延迟、幼苗死亡率高、叶绿素含量减少和光合性能降低等影响[4-5]。种子萌发期和胚根胚芽伸长期是对盐碱胁迫反应最为敏感的时期，因此采用种子萌发试验进行种质资源的耐盐碱性筛选与评价是植物抗逆性研究中一种常用的方法[6]。盐碱胁迫包括中性盐和碱性盐胁迫两大类，目前关于中性盐胁迫对种子萌发的影响研究较多[7-8]，而碱性盐胁迫对种子萌发的影响研究相对较少，本研究采用NaHCO3溶液模拟碱性盐胁迫，探究盐碱胁迫对绿穗苋(Amaranthushybriaus)种子萌发的影响以及不同基因型绿穗苋种质资源之间耐盐碱性的差异，从而为耐盐碱绿穗苋品种的选育和种植提供理论基础。

绿穗苋为苋科苋属一年生粮食、饲料、蔬菜、绿肥、医药等多种用途的新型农作物。绿穗苋根系发达，主根入土深度达2.45 m以上，侧根数量多，利用土壤中的水分、养分的能力强，对干旱、瘠薄、盐碱等逆境胁迫具有较强的耐受性，可用于改良各种不良土壤，也可用于防治水土流失、治理土地沙化[4,9]。有研究发现[10]，不同的苋属植物种质资源对盐胁迫的响应不同。因此，本试验选取8份不同来源的绿穗苋种质资源进行萌发期耐盐性鉴定，以期筛选出耐盐碱种质，为绿穗苋的耐盐机理和后期的耐盐碱绿穗苋新品种选育与应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 植物材料

供试的8份绿穗苋种质资源均来自美国农业部种质资源库(表1)。NaHCO3溶液浓度筛选试验选用的植物材料为本地籽粒苋种质资源‘1378’，保存在本课题组种质资源圃。

表1 8份绿穗苋种质资源信息Table 1 Basic information for the 8 A. hybridus germplasm resources

1.2 试验设计与处理

为了筛选合适的盐处理浓度，首先选用本地籽粒苋种质资源‘1378’进行种子萌发试验。试验采用玻璃培养皿(9 cm)进行，每皿中铺入两张大小相同的滤纸，分别加入2 mL浓度为0 mmol·L-1(CK，pH=6.80)，40 mmol·L-1(pH=8.54)，80 mmol·L-1(pH=8.42)，120 mmol·L-1(pH=8.31)，160 mmol·L-1(pH=8.26)，200 mmol· L-1(pH=8.17)的NaHCO3溶液，选取完整、饱满且无病虫害的种子，用5%的NaClO溶液消毒5 min，再用蒸馏水反复冲洗后均匀播撒在滤纸上，每皿30粒，置于25℃/20℃(光照/黑暗，14 h/10 h)的人工气候室中培养，各处理均重复4次。

根据不同NaHCO3浓度下‘1378’的种子萌发情况，确定合适的盐碱胁迫处理浓度，对8份不同来源的绿穗苋种质资源进行耐盐碱性筛选与评价，处理方式同上。

1.3 测定指标与方法

种子萌发过程中，每天同一时间采用称重法进行补水，每隔24 h记录一次种子发芽情况。于第4天计算种子发芽势，待所有种子萌发结束时计算种子发芽率，萌发结束的标准为种子3天内不再有新的发芽数[11]。种子萌发结束后从每个处理中随机选取10株苗，用精度为0.01 cm的游标卡尺对幼苗的根长和芽长进行测量。测定指标参考前人文献[12-14]，具体计算方法如下：

发芽指数=Σ(Gt/Dt)

活力指数=发芽指数×根长

其中，Gt为第t天种子的发芽量，Dt为相应的发芽试验天数。

1.4 数据处理与统计分析

试验所有数据采用Excel 2020进行整理，并运用SPSS 19.0 和DPS 9.01分析软件进行数据分析。参试材料采用模糊数学中的隶属函数法计算材料的综合隶属函数值，并对所有材料的综合耐盐性进行评价。为减少材料中单一指标的差异性过大而影响结论，计算采用了多个指标的相对值进行分析，包括相对发芽势、相对发芽率、相对根长、相对芽长、相对发芽指数和相对活力指数。

模糊隶属函数的计算公式：F=(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)，式中F表示某一项评价指标的隶属函数值，X表示某一项评价指标的测定值，Xmin，Xmax为所有参试材料某一指标的最小值和最大值；如果某一指标与抗性指标呈负相关，可通过反隶属函数计算，计算公式为：F= 1-(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)。隶属函数平均值越大表明该品种的耐盐性越强[15]。每份材料先通过模糊数学中隶属函数的公式计算出各指标的隶属值，然后再把同一品种的不同指标的隶属函数值累加求平均值，最后把平均值用DPS软件进行系统聚类分析。

2 结果与分析

2.1 不同盐碱浓度对绿穗苋种子萌发和幼苗生长的影响

由表2可知，与对照组相比，盐碱胁迫对绿穗苋的种子萌发有抑制作用，且随着NaHCO3浓度的升高，抑制作用逐渐增强，但不同指标对盐碱胁迫的响应不同：当NaHCO3浓度达到40 mmol· L-1时，与对照组相比，幼苗的根长显著缩短，但发芽势、发芽率和芽长并没有显著的变化；当NaHCO3浓度达到80 mmol· L-1时，绿穗苋的发芽势也开始显著降低(P<0.05)，但发芽率和芽长两个指标只有在NaHCO3浓度达到120 mmol· L-1后才开始显著降低(P<0.05)。综合考虑以上结果，后续试验采用100 mmol· L-1(pH 8.35)作为NaHCO3胁迫的处理浓度，用于筛选和评价不同绿穗苋种质资源的耐盐碱性。

表2 不同浓度NaHCO3溶液对绿穗苋各项观测指标的影响Table 2 Effects of different NaHCO3 solution on various indexes of A. hybridus

2.2 盐碱胁迫对不同基因型绿穗苋种子萌发的影响

种子的发芽势和发芽率是衡量植物耐盐性的重要指标之一[16]。由表3可知，在正常条件下，不同基因型绿穗苋种子间的发芽率除Ahb2外其它基因型间均无显著差异，但发芽势存在显著差异，其中Ahb2和Ahb986显著低于除Ahb1和Ahb1025外的其它基因型(P<0.05)。与对照组相比，除Ahb1外，盐碱胁迫条件下绿穗苋种子的发芽势和发芽率均出现不同程度的下降，不同基因型的种子对盐碱胁迫的响应存在显著差异。其中，基因型Ahb1，Ahb911和Ahb979对盐碱胁迫最不敏感，100 mmol·L-1NaHCO3处理条件下发芽率均高于90%，且与对照组相比无显著差异；而基因型Ahb2，Ahb984，Ahb986，Ahb1011和Ahb1025的发芽率与对照相比显著下降(P<0.05)，分别降低了34.88%，13.79%，53.85%，53.57%和52.83%。

表3 100 mmol·L-1 NaHCO3对8份不同基因型绿穗苋种子发芽势和发芽率的影响Table 3 Effects of 100 mmol·L-1 NaHCO3 on germination potential and germination rate of 8 A. hybridus seeds

盐碱胁迫条件下，基因型Ahb1，Ahb911，Ahb979和Ahb984的相对发芽势和相对发芽率均高于80%，其余基因型均较低，其中Ahb1011的相对发芽势仅为23.64%(图1)。进一步分析发现，8份材料中，大部分材料的相对发芽势和相对发芽率数值相近，只有Ahb1011的差异较大，分别为23.64%和46.43%，说明盐碱胁迫在Ahb1011种子萌发早期的抑制作用较为明显。

图1 100 mmol·L-1 NaHCO3对8份绿穗苋种子相对发芽势(a)和相对发芽率(b)的影响Fig.1 Effects of 100 mmol·L-1 NaHCO3on relative germination potential (a) and relative germination rate (b) of 8 A. hybridus seeds注：不同小写字母表示不同基因型材料间差异显著(P<0.05)。下同Note：Different lowercase letters indicate significant difference among A. hybridus resources at the 0.05 level. The same as below

2.3 盐碱胁迫对不同基因型绿穗苋幼苗生长的影响

由表4可知，正常培养条件下，本试验8份绿穗苋材料的根长之间存在一定的差异，其中基因型Ahb2的根长最短，仅12.64 mm，Ahb979的根长最长，为40.81 mm。不过正常培养条件下，除Ahb2外，其它基因型的芽长之间均无显著差异。

表4 100 mmol·L-1 NaHCO3对8份不同基因型绿穗苋根长和芽长的影响Table 4 Effects of 100 mmol·L-1 NaHCO3on root length and bud length of 8 A. hybridus

在盐碱胁迫处理下，除Ahb984外，其他试验材料的根和芽的生长均受到了显著抑制。其中，Ahb2和Ahb1025两份材料的根系受到盐碱胁迫的抑制作用最小，相对根长分别为19.76%和15.97%；Ahb911和Ahb979的根系受到盐碱胁迫的抑制作用最大，相对根长分别为9.59%和8.14%(图2a)。不同材料的芽长对盐碱胁迫的响应也存在很大差异，其中，Ahb1受到的抑制作用最为明显，相对芽长仅为32.87%，而其他基因型的相对芽长则都在40%以上。总体来看，碱性盐胁迫条件下，大部分绿穗苋材料的根系受抑制程度比芽受抑制的程度更强，不同材料的相对根长大多在20%以下，而相对芽长则在30%到50%之间(图2b)。通过计算根芽比可知，大部分材料的根芽比受到了盐碱胁迫的显著抑制，只有Ahb2和Ahb1025两份材料与对照组的差异不显著。

图2 100 mmol·L-1 NaHCO3对8份绿穗苋相对根长(2a)和相对芽长(2b)的影响Fig.2 Effects of 100 mmol·L-1 NaHCO3 on relative root length (2a) and relative bud length (2b) of 8 A. hybridus

2.4 盐碱胁迫对不同基因型绿穗苋发芽指数和活力指数的影响

由表5可知，8份不同基因型绿穗苋的发芽指数和活力指数在碱性盐胁迫处理下均有所下降，且不同基因型的下降幅度差异很大：基因型Ahb986，Ahb1011和Ahb1025的发芽指数下降幅度较大，分别高达67.16%，77.21%和69.76%，Ahb1下降幅度最小，仅10.53%；活力指数除了基因型Ahb2只下降了89.81%以外，其他材料的活力指数均下降90%以上，说明100 mmol·L-1NaHCO3盐溶液对受试种子的活力影响较大。

表5 100 mmol·L-1 NaHCO3对8份不同基因型绿穗苋种子发芽指数和活力指数的影响Table 5 Effects of 100 mmol·L-1 NaHCO3 on germination index and vigor index of 8 A. hybridus seeds

进一步分析显示(图3)，相对发芽指数较低的基因型，其种子的相对活力指数也较低，比如Ahb986，Ahb1011和Ahb1025，相对发芽指数和相对活力指数在受试材料中均较低。

图3 100 mmol·L-1 NaHCO3对8份绿穗苋种子相对发芽指数(3a)和相对活力指数(3b)的影响Fig.3 Effects of 100 mmol·L-1 NaHCO3on relative germination index (3a) and relative vigor index (3b) of 8 A. hybridus seeds

2.5 不同基因型绿穗苋种子萌发期耐盐碱性综合评价

为了全面综合反映8份绿穗苋材料的耐盐碱能力，本研究采用相对发芽势、相对发芽率、相对根长、相对芽长、相对发芽指数和相对活力指数这6项指标，根据模糊隶属函数公式计算出每一指标对应的隶属函数值，然后通过所有指标的函数值求出每个基因型的隶属函数值，并以此为标准对参试的绿穗苋材料萌发期的综合耐盐能力进行评价及排序。结果如表6所示，参试的8份绿穗苋材料的隶属函数平均值在0.182～0.707之间，综合耐盐性排序由强至弱依次为：Ahb1 > Ahb911 > Ahb2 > Ahb984 > Ahb979 > Ahb1025 > Ahb986 > Ahb1011。通过系统聚类分析，将以上8份绿穗苋材料大致分为三类：耐盐碱性较好的种质有Ahb1,Ahb911,Ahb2,Ahb984和Ahb979五个基因型，耐盐碱性中等的只有Ahb1025，对盐碱胁迫耐性较差的有基因型Ahb986和Ahb1011(图4)。

表6 绿穗苋萌发期耐盐性隶属函数及排序Table 6 Membership functions and sorting of A. hybridus during germination

图4 8份绿穗苋种质资源耐盐性聚类Fig.4 Dendrogram of salt tolerance for the 8 A. hybridus germplasm resources

3 讨论

盐碱胁迫条件下植物种子萌发情况在一定程度上体现了植物的耐盐性，因此发芽势和发芽率是衡量植物耐盐性的重要指标[6]。本研究首先采用不同浓度NaHCO3溶液对绿穗苋种子进行胁迫处理，发现NaHCO3浓度高于40 mmol· L-1时绿穗苋的各项生长指标均受到一定程度的抑制，且随着NaHCO3溶液浓度的升高，抑制作用逐渐增强，这与前人的研究相符[17-19]。同时，一些研究发现，植物不同的生长指标对盐胁迫的响应不同，比如100 mmol· L-1的盐胁迫虽然会抑制石竹(Dianthuschinensis)种子的萌发，但对植株幼苗的茎粗却有显著的促进作用[20]。本研究中也发现，植株的根长在NaHCO3溶液浓度达到40 mmol· L-1时就显著缩短，而NaHCO3溶液浓度为80 mmol· L-1时，绿穗苋的发芽势才受到显著的抑制，但该浓度条件下植株的发芽率和芽长均未受到明显影响，直至NaHCO3溶液浓度达到120 mmol· L-1时，发芽率和芽长才开始受到显著抑制。因此，本试验采用100 mmol· L-1NaHCO3溶液开展后续不同来源绿穗苋种子耐盐碱性评价。

很多研究均表明，不同植物以及同一种植物的不同品种对盐胁迫的耐性不同[21]。冯钟慧等对6个不同品种的苋属植物种子进行萌发期耐盐性鉴定，结果表明不同材料的种子萌发期耐盐性表现差异显著[22]。植物作为一个复杂的生命体，其对盐碱胁迫的响应涉及到多种生理生化反应，包括离子稳态、渗透调节剂的合成、活性氧的清除和内源激素的代谢等[23-24]。同时，植物的很多生长发育过程都会受到盐碱胁迫的影响，只使用单项指标难以全面准确地反映植物品种的耐盐碱能力[25-26]。因此，本研究在总结前人分析方法的基础上，采用系统聚类分析及模糊隶属函数等分析方法，选取盐碱胁迫条件下6项生长指标的变化来评价绿穗苋种质资源的耐盐碱性强弱，避免了只分析单一指标的片面性，使分析结果更加可靠[27]。

根据种子萌发相关指标可以对不同品种的耐盐性进行分类，比如，宋家兴等人根据相对发芽势、相对发芽率、相对发芽指数、相对根长和相对芽长5个指标将37份无芒雀麦(Bromusinermis)进行聚类分析，划分为耐盐、敏盐、中度耐盐3种类型[28]。本研究中亦采用相似方法，根据盐碱胁迫下不同基因型的8份绿穗苋材料的各项指标进行聚类分析，发现大部分品种(80%左右)比较耐盐。本研究还发现，盐碱胁迫对植物根生长的抑制作用比对芽更加显著，这也与徐曼等[29]和郭慧娟等人[30]的研究结果相符合。

4 结论

本研究通过对8份绿穗苋种子萌发期主要的生长指标进行分析，发现盐碱胁迫处理对绿穗苋的生长发育具有一定的抑制作用，且参试的8份材料其各项指标对盐碱胁迫的响应不同，通过隶属函数法分析，对受试8份绿穗苋种质资源萌发期耐盐性强弱进行排序，结果为：Ahb1>Ahb911>Ahb2>Ahb984>Ahb979>Ahb1025>Ahb986>Ahb1011。通过聚类分析可以将受试种质资源分为三大类，其中对盐碱胁迫耐性较好的有Ahb1，Ahb2，Ahb984，Ahb911和Ahb979五个基因型，耐盐碱性中等的只有Ahb1025，Ahb986和Ahb1011耐盐碱性较差。