王 璞，蔡玉荣，张 刚，孔云逸，穆爱娟，李 勇

结核分枝杆菌(MTB)是一种引起人兽共患的传染性疾病的病原菌。与其他病原菌相比，MTB不产生毒素，其致病物质主要是荚膜成分、脂类以及蛋白质，尤其是MTB基因组上有许多表达蛋白质的基因[1]，其中许多蛋白(家族)是与细菌致病性相关的毒力因子。近年来研究发现，MTB基因组上存在一个特殊的富含甘氨酸的基因家族——PE/PPE基因家族，约占基因组编码区的10%，共编码168个蛋白。这些蛋白家族成员在MTB的细菌毒力、亚细胞定位、细菌免疫逃逸、宿主细胞的命运中起关键作用。当MTB经呼吸进入肺泡时，PE/PPE蛋白家族成员能介导MTB的粘附和侵袭宿主肺泡中的巨噬细胞[2-3]，并且JNK MAPK、NF-κB等信号分子参与了PE/PPE蛋白介导的病原与宿主免疫细胞之间的相互作用。此外，PE/PPE蛋白还可作为潜在的特异性诊断试剂和抗结核疫苗的成分。本文将围绕上述内容作一综述和展望，以期为MTB的临床致病机理和防控提供理论参考。

1 PE/PPE蛋白家族的结构特征

PE/PPE蛋白家族以其N末端结构域中的保守脯氨酸(P)和谷氨酸(E)残基命名，PE蛋白存在Pro-Glu(PE)基序，PPE蛋白存在Pro-Pro-Glu(PPE)基序，这些基序都是MTB毒力因子和T细胞抗原的重要表位。PE/PPE蛋白的N末端是高度保守的，PE蛋白N端大约由110个氨基酸组成，PPE蛋白大约由180个氨基酸组成，形成α-β-α的螺旋束结构，但C端序列呈高度多态性，变异较大，且在感染过程中选择性表达，这有利于病原体逃避宿主的攻击，因此C端基因的突变可能会导致MTB毒力的减弱[4]。

PE/PPE蛋白家族包含69个PPE蛋白成员以及99个PE蛋白成员，根据C末端结构域的同源性和特异性基序进行分类，其中PPE蛋白可分为4个亚家族，分别是PPE_SVP(带有Gxx-SVPxxW基序)，PPE_PPW(带有PxxPxxW基序)、PPE_MPTR(多肽串联重复序列)和没有特征的PPE；PE蛋白分为2个亚家族，PE和PE_PGRS(polymorphic GC-rich-repetitive sequence，富含GC的多态性重复序列)[5]。Phan等[6]发现，PE基因的下游是PPE基因，PPE蛋白通过N末端的3个疏水性α螺旋与其PE蛋白相互作用，并以异二聚体形式分泌。这种异二聚体结构将PPE蛋白的保守序列WxG和PE蛋白的YxxxD/E序列紧密相连，而这些序列可能是Type Ⅶ(Type Ⅶ secretion system, T7SS)分泌的识别结构[7]。这种PE和PPE的结构类似于ESX蛋白形成的异二聚体的结构，例如ESAT-6HE CFP10。这些数据表明，螺旋束结构和复合分泌信号是PE和PPE异二聚体以及其他与Type Ⅶ型相关底物的结构特征。

PE/PPE蛋白主要存在于致病性分枝杆菌，在非致病性结核分枝杆菌中的含量较少，因此PE/PPE蛋白可能在分枝杆菌的毒力、发病机制中起独特的作用。

2 PE/PPE蛋白家族的生物学功能

目前已报道MTB的PE/PPE蛋白家族成员中有超过35种定位于分枝杆菌细胞膜或细胞壁上，与细胞壁相关的蛋白可能介导病原体-宿主的相互作用，所以细胞定位可能参与调控MTB不同的生物学功能[8]，其中一些PE/PPE蛋白可以攻击宿主的免疫系统，影响MTB的毒力，促进MTB在胞内的定殖，或与宿主细胞竞争性获取铁等[9]。

2.1 MTB的毒力调控 研究发现，PE/PPE蛋白可调控MTB的毒力。最新研究结果表明[10]，利用MTB H37Rv的野生株(WT)、PPE25-PE19突变株和△PPE25-PE19：：esx-5回补株分别以1×104CFU/只的剂量通过鼻内途径感染C57BL/6小鼠，结果发现，在感染后28 d，△PPE25-PE19突变株仅观察到巨噬细胞和淋巴细胞对支气管和血管周围浸润较小且没有发现MTB。而在△PPE25-PE19：：esx-5回补株感染的小鼠肺中发现巨噬细胞、上皮细胞、淋巴细胞和浆细胞的广泛浸润，并且检测到MTB的大量增殖。这些数据表明，PPE25-PE19作为MTB的致病因子增加了细菌的毒力、感染、增殖以及致病性等能力。另外有研究发现，MTB的ESX-5分泌系统分泌的PE_PGRS和PPE_MPTR蛋白可降低MTB的毒力。PPE38的功能突变可以完全阻断这2个亚家族的分泌，在北京谱系的临床MTB中发现具有这种突变，并伴随着分泌蛋白的丧失。在中等致病性MTB中，PPE38缺失株会导致细菌负荷和炎症因子的显著增加，从而增强了细菌毒力，这表明ESX-5底物在毒力衰减作用中起着重要的作用，但无法揭示ESX-5底物对PPE38的依赖机制[11]。

2.2 MTB在巨噬细胞内的存留时间 PE/PPE蛋白为了劫持宿主巨噬细胞并在细胞内存活，MTB需要模拟宿主蛋白质功能，以此调节宿主细胞的命运。MTB膜蛋白中的PE/PPE蛋白(如：PPE39、PE_PGRS11、PE9等)可直接与巨噬细胞TLR2/4受体发生相互作用，并改变其胞内环境，从而有利于延长细菌的生存时间。研究发现，用表达PE_PGRS33的耻垢分枝杆菌(M.smegmatis，M.s)通过腹腔感染C57BL/6小鼠，结果显示小鼠骨髓巨噬细胞的存活率增加，使得M.s在巨噬细胞内的存留时间延长，这可能是此类蛋白可以通过抗原变异或抑制MHC I(major histocompatibility complex I，MHC I)类分子的呈递，从而在宿主细胞中持续存在。据此推测，PE_PGRS蛋白可能与MTB自身的免疫逃逸机制有关[12]。Mi等[13]用M.s_PPE26感染BALB/c小鼠，6 d后取小鼠的肝，脾和肺组织来确定其细菌负荷量，发现在感染 6 d后，细菌负荷量减少，这些结果表明在非致病性M.s中表达PPE26可使M.s在小鼠巨噬细胞中的存活率升高。另外，在MTB还发现PE4、PE5和PE15等蛋白可通过抑制一氧化氮合酶(iNOS)的合成从而终止亚硝化应激[14]，使宿主巨噬细胞保持完整的结构，从而延长MTB在巨噬细胞内的存活时间。

2.3 竞争性获取宿主细胞铁离子 铁离子是人体的固有微量元素之一，从宿主细胞获取铁离子对于MTB的复制和毒力调控具有重要作用。铁离子通常被螯合在宿主细胞内，在感染过程中，MTB通过铁载体介导的铁获取(SMIA)和血红素铁获取(HIA)这2种途径从中获取铁。当铁载体生物合成受到干扰时，SMIA缺陷的MTB突变体在含有130 μmol/L Fe3+的标准7H9培养基中不会出现持续的生长，会在存储铁耗尽时停止生长，而添加外源铁载体后可恢复MTB生长。另外，研究发现，对血红素铁的获取可能在MTB致病过程中起关键作用。PPE36、PPE62蛋白可结合血红素，然后血红素加氧酶在细胞内降解血红素以释放Fe2+；此外，PPE37也参与了血红素的摄取[15]，但不参与铁降解与释放，此机制有待进一步研究。因此在分枝杆菌致病过程中血红素铁获取起关键作用，重要PE/PPE蛋白功能见表1。

表1 重要PE/PPE蛋白的功能Tab.1 Important PE/PPE protein function

3 对宿主免疫反应的调控

3.1 调控宿主先天免疫反应 机体先天具有正常的生理防御功能，可对MTB的入侵作出相应的免疫应答，其中，作为先天免疫的重要吞噬细胞，巨噬细胞的防御机制就是通过吞噬体的成熟和酸化，来杀死病原体，但是MTB中的PE/PPE蛋白可能破坏这一机制并引起宿主巨噬细胞的自噬、凋亡，最终使得MTB存活。

3.1.1 巨噬细胞的抑制 PE_PGRS47在调控MTB抗宿主的先天免疫中可能是一个功能性，非冗余的细菌因子，可通过对自噬的抑制来影响MTB的生存策略和免疫逃避。Saini NK等[36]通过对PE_PGRS47感染巨噬细胞呈递MHC Ⅱ类分子进行全基因组筛选发现，PE_PGRS47(Rv2741)抑制了抗原呈递和巨噬细胞自噬，并对PE_PGRS47基因进行靶向破坏进而导致MTB在体外和体内生长减慢。当用PE_PGRS47的MTB突变体感染小鼠巨噬细胞系RAW264.7时，MHC Ⅱ类分子呈递增加，RAW264.7细胞内LC3与细菌共定位增加，这些结果表明PE_PGRS47可抑制巨噬细胞的自噬。另外，分泌型PE_PGRS和PPE_MPTR蛋白是调节巨噬细胞反应的主要毒力效应蛋白。PE_PGRS30就是通过抑制吞噬体融合从而在宿主细胞中存活下来。从鸟分枝杆菌中敲除PPE25基因，可减少巨噬细胞内MTB的复制并抑制吞噬体融合。由此可知，MTB可依靠专门的分泌途径来分泌毒力效应蛋白，它们可以利用一系列的致病性效应物调节宿主蛋白并通过抑制吞噬体的酸化和成熟，进而在宿主免疫细胞(主要是巨噬细胞)中存活并复制[37]。

MHC ⅠⅡ：Antigen-presenting cell；ER stress：endoplasmic reticulum stress.图1 PE/PPE蛋白调节宿主天然免疫反应Fig.1 PE/PPE proteins regulate the host's natural immune response

3.1.2 巨噬细胞凋亡 MTB对细胞凋亡的抑制有助于延长宿主细胞的生存，从而维持其在宿主中的持久性滞留与增殖，并进行全身性的传播。通常MTB可能会在感染的早期阶段阻止细胞凋亡，使其在营养丰富的宿主细胞环境中得到复制；到后期，由于宿主营养缺乏，生长受限从而诱导细胞凋亡[38]。例如，Deng等[39]用Ms_PE_PGRS41感染THP-1巨噬细胞，结果表明THP-1中caspase-3和caspase-9的裂解均降低，当过表达PE_PGRS41时，可抑制M.s感染的THP-1巨噬细胞的凋亡。Long等[26]用Ms_Vec和Ms_PE_PGRS62感染PMA分化的巨噬细胞，并使用Annexin-V-FITC和PI检测细胞凋亡水平，结果表明，与空载体对照Ms_Vec相比，Ms_PE_PGRS62早/晚期凋亡率下降，这些数据表明PE_PGRS62可以抑制巨噬细胞的凋亡。

PE/PPE蛋白质家族成员的C末端还有诱导巨噬细胞凋亡的作用，如：PPE37的C末端可诱导依赖于caspase-3的宿主细胞凋亡[40]，这可能是在凋亡小泡受保护环境下，MTB繁殖的生存策略。在MTB感染的细胞中，抗原呈递细胞的凋亡是一种可以启动宿主先天性免疫应答的防御机制，Gastelum-Avina等[41]发现PE_PGRS33的PGRS结构域通过与TLR2相互作用改变细菌形态并介导MTB侵入巨噬细胞，诱导肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α)的分泌、增加凋亡标记物乳酸脱氢酶(LDH)的释放，进而来触发巨噬细胞凋亡，推测PGRS结构域的多态性影响了PE_PGRS33触发了巨噬细胞分泌TNF-α的能力。

3.1.3 内质网(ER)应激的激活 在内质网应激过程中，X-盒结合蛋白1(XBP-1)是未折叠蛋白反应中的一个关键限速调控因子，参与内质网内环境稳态以及细胞结构完整性等方面的调控。为研究PPE32、内质网应激和细胞凋亡之间的关系，用PPE32刺激人巨噬细胞THP-1，检测XBP-1的表达和主要分子伴侣蛋白的激活，发现78-kDa葡萄糖调节蛋白(GRP78)和C/EBP同源蛋白(CHOP)与ER应激相关，推测PPE32诱导了ER应激相关蛋白GRP78的表达，从而引起巨噬细胞的凋亡[17]。

Sonam等[42]用PE_PGRS5的PGRS域转染RAW 264.7巨噬细胞，发现PE_PGRS5的PGRS结构域有助于ER定位并激活ER应激途径。在RAW 264.7细胞中检测到Ca2+水平增加，与ER应激诱导的细胞凋亡过程中关键蛋白GRP78/GRP94和CHOP/ATF4的表达量显著增加，从而破坏了细胞内Ca2+稳态，导致NO和ROS的生成，结果表明PE_PGRS5蛋白中PGRS域诱导了GRP78/GRP94和CHOP/ATF4的表达，进而导致巨噬细胞凋亡，见图1。

3.2 调控宿主获得性免疫反应 PE/PPE蛋白家族能够诱导T细胞免疫反应，而树突状细胞(Dendritic cells, DC)的活化是引起该免疫反应的关键。未成熟的DC摄取抗原后会发生迁移，通过淋巴管进入局部淋巴结，进而分化为成熟的DC，提呈抗原并激发T细胞免疫应答。例如，PE27就是通过上调CD80、CD86、MHC I类和MHC II类分子的表达来活化DC，且伴随着TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-12p70的分泌增加，从而引起Th1细胞极化[43]。

PE/PPE蛋白家族可以通过诱导未成熟DC细胞向Th1细胞极化，并参与炎症反应的调控。Choi等[44]研究发现，PPE39蛋白可通过MAPK和NF-κB信号通路介导DC的活化，活化的DC可以促进CD4+T细胞增殖并伴随着IFN-γ和IL-2的分泌，以及Th1型细胞相关转录因子T-bet的增加，但与Th2相关的GATA-3表达却没有增加，这说明PPE39与DC相互作用诱导偏向Th1型的细胞免疫反应[44]。近期PPE22，Rv1485也被发现具有保护功效[45]，分析PE/PPE蛋白PPE22(最强的候选者)的抗原决定簇，鉴定出其N末端有一个可发生免疫反应的抗原表位，使得细菌负荷量降低，通过评估IgG2a/IgG1比例和细胞因子的释放，结果表明PPE22，Rv1485诱导保护性Th1免疫反应。PPE57和PPE26介导巨噬细胞的活化并以TLR2依赖性方式触发Th1型免疫反应。Xu Y等[46]发现PPE57和PPE26与TLR2相互作用，可促进细胞表面分子(CD40，CD80，CD86和MHC Ⅱ类)和TNF-α，IL-6和IL-12p40的表达，进而触发由MAPK和NF-κB信号通路介导的巨噬细胞活化。另外，PPE57和PPE26在体内可有效介导T细胞极化以分泌IFN-γ和IL-2并增强趋化因子3(CXCR3)的表达。表明这些蛋白质可能在免疫应答过程中也可以促进Th1极化，最终引起宿主炎症反应。

但也有一些PE-PPE复合物可调节Th2型的免疫反应，减少促炎细胞因子的产生，这样有助于细菌在宿主内的存活。然而MTB使用的一种主要的免疫逃避机制就是故意引起Th2免疫反应，反过来下调抗分枝杆菌的Th1反应。Khubaib等[47]发现用PPE65感染RAW264.7细胞，随着PPE65浓度的增加，观察到脾细胞培养上清液中的IFN-γ水平降低，与Th2型相关的IgG1显著增加，这预示着PPE65抑制Th1型免疫反应，使得Th2型的免疫反应占主导地位。因此，PE/PPE蛋白作为潜在的免疫调节蛋白，可通过平衡Th1/Th2反应来参与MTB感染的建立与维持，从而使MTB在宿主体内存活。

综上所述，PE/PPE蛋白能够被宿主免疫系统识别，调节宿主的先天免疫和获得性免疫反应[30]。该家族蛋白与巨噬细胞TLRs相互作用，诱导凋亡和炎症因子的释放，进而引起T细胞和B细胞免疫应答(图2)。

图2 PE/PPE蛋白调节宿主获得性免疫的信号转导Fig.2 PE/PPE proteins regulate the signal transduction of host acquired immunity

4 PE/PPE蛋白作为疫苗靶标

目前用于结核病预防的疫苗为卡介苗，由于卡介苗只能预防儿童的结核性脑膜炎和粟粒性肺结核，而对成人结核病没有预防作用且对成年动物的免疫效果并不明显，短时间之内很难提高保护效力。因此，人们对预防结核病的DNA疫苗、亚单位疫苗进行了广泛的研究，并且亚单位疫苗成为MTB疫苗研究的热点领域。近年来研究较多的亚单位疫苗的抗原为MTB Ⅶ型分泌系统(ESX-3)分泌的EAST-6、CFP10、Ag85A和Ag85B等，并且只有H56：IC31(EAST-6)、ChAdOx1 85A-MVA85A等进入二期临床[48]。为了筛选更好的MTB抗原用于结核病疫苗的开发，MTB分泌系统ESX-5分泌的PE/PPE家族蛋白成为潜在的候选抗原。

当前，以PE/PPE蛋白作为抗原成分的疫苗有M72：AS01E和ID93/GLA-SE，其中M72：AS01E是目前最先进的蛋白质佐剂疫苗，旨在促进BCG诱导的免疫反应，M72抗原由MTB 32A和MTB 39A 重组融合蛋白组成，使用AS01E佐剂刺激免疫系统可以有效地将抗原递送至抗原呈递细胞，从而募集单核细胞和中性粒细胞，诱导快速的先天免疫应答[49]。在临床IIb期试验中，M72：AS01E疫苗可诱导M72产生特异性抗体和CD4+T细胞的免疫反应，在健康受试者中具有可接受的临床安全性。

还有一种以Rv3619、Rv3620、Rv1813和PPE42为抗原的亚单位疫苗——ID93/GLA-SE疫苗，该疫苗由四价融合蛋白组成，所使用的佐剂是水包油型乳剂，其中嵌入了TLR4受体激动剂。在临床前研究中，已发现ID93/GLA-SE疫苗可有效预防小鼠和豚鼠感染MTB[50]，并增加了IgG1和IgG3抗体的表达，诱导了Th1型细胞的免疫应答。ID93/GLA-SE疫苗已成功在成人Ⅰ期临床试验中证明了其安全性和免疫原性，现已进入Ⅱb期临床试验。

除进入临床试验的PE/PPE蛋白外，还有一种较好的潜在抗原表位蛋白质——PE_PGRS33蛋白[51]，其PE结构域序列可以与MPT64基因序列融合，这种嵌合蛋白能增强对机体的保护，减少MTB对机体的感染，实验证明可利用这种蛋白质来开发抗结核病疫苗。虽已有多个候选疫苗已进入临床实验(PPE44，PPE38，PPE32，PPE18[33]等)，但是新型结核病疫苗的开发仍面临着许多挑战，例如，缺乏清晰的保护性抗原、缺乏合适的动物模型、可靠的临床前评估指标、免疫人群的复杂性等问题。

5 展 望

PE/PPE蛋白的功能研究已有十多年的历史，与其他分枝杆菌蛋白相比，PE/PPE蛋白的生物学结构仍然知之甚少。现如今需要关注的领域包括PE/PPE结构生物学、PE/PPE宿主靶标的识别、病原体与细胞的相互作用以及对这些蛋白调节宿主免疫反应的机制。PE/PPE蛋白的结构生物学是一个亟待研究的领域，清晰的PE/PPE蛋白的结构可以确定PE/PPE蛋白的宿主靶标，更能全面地了解PE/PPE蛋白发生变异的抗原表位、对宿主的感染机制，免疫逃逸以及如何导致MTB的致病性等。这对于深入了解结核分枝杆菌的毒力非常重要，预示着PE/PPE蛋白可能是疫苗和新药靶标的来源，可成为抗结核病疫苗的组成部分。