杨 玲，张 栋，齐世华，马新颖，周帅康，艾连中，王世杰,

（1.河北一然生物科技有限公司，河北 石家庄 050800；2.石家庄君乐宝乳业有限公司，河北 石家庄 050221； 3.河北科技大学生物科学与工程学院，河北 石家庄 050018；4.上海理工大学医疗器械与食品学院，上海 200093）

双歧杆菌是人和动物肠道内最重要的益生菌之一，对维持宿主健康起着重要作用[1]。研究表明，双歧杆菌具有抗衰老[2-4]、提高免疫力[5-6]、抗感染[7-9]、改善肠道 功能[10-12]和脑部功能[13-15]等功效。

两歧双歧杆菌（Bifidobacterim bifidum）TMC3115是一株分离自人体的益生菌，具有调节代谢、抗过敏等功效[16-20]。然而，我国益生菌产业起步较晚，双歧杆菌的生产技术与发达国家存在差距，限制了我国相关产业的发展。同时双歧杆菌本身的厌氧特性也造成了其菌粉生产难度较大。因此，研究两歧双歧杆菌关键生产技术成为突破益生菌产业瓶颈的关键。本研究针对两歧双歧杆菌TMC3115的初始发酵条件、培养基配方、冻干保护剂及冻干工艺进行筛选与优化，并将试验结果应用于工业化生产中。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

两歧双歧杆菌TMC3115由河北一然生物科技有限公司菌种保藏中心提供，分离自健康婴儿肠道。

葡萄糖 山东西王药业有限公司；乳糖 江苏长晶生物工程有限公司；蔗糖 广西田林和平糖业有限 公司；大豆蛋白胨、牛骨蛋白胨 山东玉宝生物科技股份有限公司；酪蛋白胨 北京鸿润宝顺科技有限公司；胰酪蛋白胨 山东伟多丰生物技术有限公司；酵母浸粉FM902、酵母浸粉FM808 安琪生物集团有限公司；脱脂乳粉、乳清粉 新西兰恒天然公司；海藻糖、谷氨酸钠、谷氨酸、脯氨酸 梅花生物科技集团股份有限 公司；抗坏血酸、抗坏血酸钠、甘氨酸 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；异D-抗坏血酸钠、精氨酸 江苏采薇生物科技有限公司；L-半胱氨酸盐酸盐 深圳金富源生物科技有限公司；甘露醇、山梨醇 山东天力药业有限公司；MRS培养基 北京陆桥技术股份有限公司；丙三醇 安徽千品生物科技有限公司；硫酸镁、硫酸锰、柠檬酸氢二铵、无水乙酸钠、磷酸氢二钾 石家庄现代仪器仪表化工有限公司。

1.2 仪器与设备

FE28 pH计 瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司；722N可见分光光度计 上海仪电分析仪器有限公司；DL-CJ-2ND Ⅱ超净工作台 北京东联哈尔仪器制造有限公司；BPH-9272精密恒温培养箱 上海一恒科学仪器有限公司；BLBIO-3GJ-4-H自动发酵罐 上海百伦生物科技有限公司；GL-21M离心机 上海市离心机械研究所有限公司；FD8-4冻干机 美国西盟国际集团。

1.3 方法

1.3.1 培养基的筛选及培养条件的确定

用于培养双歧杆菌的改良MRS培养基基础成分为：蛋白胨10 g/L、牛肉膏10 g/L、酵母提取物5 g/L、葡萄糖20 g/L、柠檬酸氢二铵2 g/L、无水乙酸钠5 g/L、磷酸氢二钾2 g/L、吐温-80 1 g/L、硫酸镁0.58 g/L、硫酸锰0.25 g/L、L-半胱氨酸盐酸盐0.5 g/L，以此为基础进行碳源及氮源优化。

1.3.1.1 碳源及氮源优化

以MRS培养基作为基础培养基，使用葡萄糖、乳糖、蔗糖替代碳源，添加量均为2%，分别于37 ℃培养16 h，测定发酵液的pH值、600 nm波长处光密度（OD600nm）及活菌数，进行碳源初筛。

使用大豆蛋白胨、酪蛋白胨、牛骨蛋白胨、胰酪蛋白胨、酵母浸粉FM902、酵母蛋白胨、酵母浸粉FM808替代氮源，添加量均为1%，分别于37 ℃厌氧培养16 h，测定发酵液的pH值、OD600nm及活菌数，进行氮源初筛。

利用正交试验，将初筛中碳源和氮源中效果最好的组分进行优化组合，最终确定高密度发酵培养基。

1.3.1.2 培养基初始pH值对两歧双歧杆菌TMC3115生长的影响

以MRS培养基为基础培养基，初始pH值分别设定为6.4、6.8、7.0、7.2、7.4，分别于37 ℃厌氧培养16 h，测定发酵液pH值、OD600nm及活菌数。

1.3.1.3 接种量对两歧双歧杆菌TMC3115生长的影响

将两歧双歧杆菌TMC3115分别以2%、3%、4%、5%的接菌量接入改良培养基中，37 ℃厌氧培养16 h，测定发酵液pH值、OD600nm及活菌数。

1.3.2 两歧双歧杆菌TMC3115发酵终止时间的确定

在最终确定的培养条件和培养基中对两歧双歧杆菌TMC3115进行发酵（37 ℃、24 h），分别在发酵0、2、4、6、8、10、12、14、16、18 h取发酵液，测定 pH值、OD600nm和活菌数，绘制最终的发酵曲线，确定发酵终止时间。

1.3.3 冻干保护剂的筛选

分别配制常用的复合类、多元醇类、糖类、氨基酸类、抗氧化剂类等共18 种不同的冻干保护剂（表1）溶液，在同一条件下冻干，分别检测冻干存活率，再进行正交试验，确定冻干保护剂配方。

表1 实验所用不同种类冻干保护剂Table1 List of cryoprotectants tested in this study

冻干存活率按下式计算。

式中：n1为乳化液活菌数/（CFU/g）；m1为乳化 液质量/g；n2为冻干粉活菌数/（CFU/g）；m2为冻干粉质量/g。乳化液指冻干前从高密度培养基中获得的菌泥与冻干保护剂混合后所得溶液。

1.3.4 复合冻干保护剂的筛选

从各类单体保护剂中选出冻干存活率较高的冻干保护剂，用正交试验进行复合，比较冻干后菌粉活菌数，筛选出最佳冻干保护剂组合。

1.3.5 菌泥与冻干保护剂质量比优化

设定菌泥与冻干保护剂质量比分别为1∶1.2、1∶1.4、1∶1.6、1∶1.8、1∶2.0，并在同一条件下进行冻干，检测冻干后菌粉活菌数。

1.4 数据处理

pH值、OD600nm、活菌数测定均设置3 组平行实验，结果以平均值±标准差表示，均采用SPSS软件进行数据统计。

2 结果与分析

2.1 培养基碳源、氮源及培养条件的确定

2.1.1 碳源、氮源的确定

碳源主要为微生物生长提供细胞的碳架、细胞生命活动所需的能量以及提供合成产物的碳架。一般的微生物培养中碳源主要采用糖类物质。由表2可知，两歧双歧杆菌TMC3115对葡萄糖的利用度最高，其次为乳糖，因此，选择葡萄糖作为两歧双歧杆菌TMC3115培养基的基础碳源。

表2 不同碳源对两歧双歧杆菌TMC3115生长的影响Table2 Effects of different carbon sources on the growth of Bifidobacterim bifidum TMC3115

氮源是构成蛋白质和核酸等的主要元素，也是微生物的大量营养物。由图1可知，胰酪蛋白胨、酵母蛋白胨、酵母浸粉FM902、酪蛋白胨对两歧双歧杆菌TMC3115的培养效果较好。

图1 不同氮源对两歧双歧杆菌TMC3115生长的影响Fig. 1 Effects of different nitrogen sources on the growth of Bifidobacterim bifidum TMC3115

与本研究结果不同的是，熊三玉[21]研究发现，牛肉膏对双歧杆菌培养液的OD600nm有较大正向影响。这可能与菌株自身特性有关。鉴于酪蛋白胨效果并不是最好而且价格偏高，选择胰酪蛋白胨、酵母蛋白胨、酵母浸粉FM902进行碳、氮源筛选正交试验。

表4 碳、氮源筛选4因素3水平正交试验结果Table4 Orthogonal array design in terms of coded values and experimental results for optimization of carbon and nitrogen sources

对正交试验结果进行极差分析，由表3～4可知，碳、氮源对两歧双歧杆菌TMC3115生长影响大小依次为B（胰酪蛋白胨）＞C（酵母蛋白胨）＞D（酵母浸粉FM902）＞A（葡萄糖）。根据K值比较得出理论最优组合为A2B3C1D3，即葡萄糖添加量25 g/L、胰酪蛋白胨添加量20 g/L、酵母蛋白胨添加量10 g/L、酵母浸粉FM902添加量15 g/L。

表3 碳、氮源筛选4因素3水平正交试验因素水平Table3 Coded values and corresponding actual values of carbon and nitrogen source concentration used for orthogonal array designg/L

2.1.2 初始培养pH值确定

双歧杆菌有其最适生长pH值，培养基的初始pH值过高或过低都会影响其正常生长。对于不同的双歧杆菌，最适初始pH值有所不同。熊三玉[21]研究发现，双歧杆菌生长最佳pH值为6.5～8.5。而舒国伟等[22]研究表明，两歧双歧杆菌BB01及BB03的最佳发酵初始pH值分别为6.5和6.0。

由表5可知，随着培养基初始pH值的升高，两歧双歧杆菌TMC3115发酵液OD600nm先升高后降低，发酵液活菌数也是同样的变化趋势，最适初始pH值为7.2。

表5 不同培养基初始pH值对两歧双歧杆菌TMC3115的影响Table5 Influence of initial medium pH on viable cell count of Bifidobacterim bifidum TMC3115

2.1.3 接种量确定

双歧杆菌有其最适接种量，接种量过高或过低都会影响其菌体生长和产酸。国内研究结果中不同菌株的最佳接种量差异不大，为3%～6%[21-23]。由表6可知，两歧双歧杆菌TMC3115接种量4%时所得的发酵液活菌数最高。

表6 不同接种量对两歧双歧杆菌TMC3115生长的影响Table6 Effects of different inoculum amounts on the growth of Bifidobacterim bifidum TMC3115

2.2 两歧双歧杆菌TMC3115发酵终止时间

图3 两歧双歧杆菌TMC3115发酵液活菌数变化曲线Fig. 3 Variation in viable cell number during the culture of Bifidobacterim bifidum TMC3115

由图2～3可知，随着发酵时间的延长，发酵液OD600nm、活菌数增大，pH值减小，发酵16 h时，菌落生长到达稳定期，此时的活菌数最高，而pH值接近最低，说明此时发酵液产酸最多，因此选择16 h作为最终发酵时长。

图2 两歧双歧杆菌TMC3115发酵液pH值、OD600 nm变化曲线Fig. 2 Variations in pH and OD600 nm during the culture of Bifidobacterim bifidum TMC3115

2.3 冻干工艺优化结果

2.3.1 冻干保护剂的筛选

菌体冷冻干燥后的存活率受多种因素影响，而保护介质是其中重要的影响因素，良好的保护剂要求其在冻干过程中能为菌体提供保护作用，降低菌体死亡率。同时，有较好的自身稳定性，容易与菌泥均匀混合，还可方便、有效除去冻干材料中的多余溶剂[24]。

由表7可知：对于两歧双歧杆菌TMC3115来说，蛋白类冻干保护剂保护能力整体较高，如脱脂乳、乳清粉、酵母浸粉；多元醇类冻干保护剂中丙三醇效果最好；糖类冻干保护剂中海藻糖效果最好；氨基酸及氨基酸盐类冻干保护剂中谷氨酸钠效果最好，其次为脯氨酸；抗氧化剂类冻干保护剂中L-半胱氨酸盐酸盐效果最好。

表7 不同冻干保护剂对两歧双歧杆菌TMC3115冻干存活率的影响Table7 Effects of different freeze-drying protectants on freeze-drying survival rate of Bifidobacterium bifidum TMC3115

2.3.2 复合冻干保护剂的筛选

由表8～9可知，对菌粉活菌数影响力大小依次为脱脂乳＞海藻糖＞丙三醇=谷氨酸钠＞L-半胱氨酸盐酸盐，理论最佳组合为A4B4C1D4E1，最优保护剂配方为脱脂乳添加量12%、海藻糖添加量12%、丙三醇添加量1.2%、谷氨酸钠添加量0.6%、L-半胱氨酸盐酸盐添加量0.15%。对于保护剂的筛选，不同研究中采用了不同的保护剂[24-25]。但是研究者均通过正交试验证明复合保护剂优于某一种保护剂，可能是由于不同类型的保护剂通过不同保护机制的协同作用，达到了更好的保护效果。

表8 复合冻干保护剂5因素4水平正交试验因素水平Table8 Coded levels and corresponding actual levels of five freezedrying protectants in their blends used for orthogonal array design%

表9 复合冻干保护剂5因素4水平正交试验结果Table9 Orthogonal array design in terms of coded values with experimental results for optimization of freeze-drying protectant blends

2.3.3 菌泥与冻干保护剂质量比优化

由表10可知，随着冻干保护剂添加量的增加，菌粉活菌数呈上升趋势，菌泥与冻干保护剂质量比1∶1.8时，菌粉活菌数达到最高，继续增加冻干保护剂用量，菌粉活菌数反而降低。因此，菌泥与冻干保护剂最佳质量比为1∶1.8。经过各项条件优化生产的两歧双歧杆菌TMC3115菌粉活菌数达到4.26×1011CFU/g。

表10 菌泥与冻干保护剂质量比对菌粉活菌数的影响Table10 Effect of mass ratio between bacterial cells and freeze-drying protectant on the number of live cells after freeze-drying

3 结 论

本研究通过对两歧双歧杆菌TMC3115发酵培养基、pH值、接种量及发酵曲线的研究，得出培养基配方为葡萄糖添加量25 g/L、胰酪蛋白胨20 g/L、酵母蛋白胨10 g/L、酵母浸粉FM902 15 g/L、柠檬酸氢二铵2 g/L、无水乙酸钠5 g/L、磷酸氢二钾2 g/L、吐温-80 1 g/L、硫酸镁0.58 g/L、硫酸锰0.25 g/L、L-半胱氨酸盐酸盐 0.5 g/L，pH值7.2，接种量4%，最佳发酵时长为16 h。通过冻干保护剂配方优化和冻干保护剂与菌泥乳化比例研究，得出最优冻干保护剂配方为：脱脂乳添加量12%、海藻糖12%、丙三醇1.2%、谷氨酸钠0.6%、L-半胱氨酸盐酸盐0.15%，菌泥与冻干保护剂最佳质量比为1∶1.8。经过验证，最终制备的两歧双歧杆菌TMC3115菌粉活菌数达到4.26×1011CFU/g。本研究对于降低两歧双歧杆菌TMC3115的生产成本、提高其产能具有良好的指导作用。下一步将研究两歧双歧杆菌TMC3115的储运和保存环境，以提高其货架期稳定性，继续为国产益生菌的生产与应用提供基础数据。