张文乐，岳田利，周嘉佳，朱 璇，王 英,

（1.新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆 乌鲁木齐 830052；2.西北大学食品科学与工程学院，陕西 西安 710069）

苹果汁贮藏过程中存在的主要问题是酵母生长导致的腐败，造成了严重的经济损失[1]。其中，耐高渗酵母（Zygosaccharomyces rouxii）因具有能在高浓度糖环境中生长的能力以及对高水平防腐剂（山梨酸钾、苯甲酸钠）的抵抗力，成为导致含糖果汁腐败的主要因素[2]。耐高渗酵母的存在会导致苹果汁出现多种品质问题：一方面，耐高渗酵母可以在低pH值下生长，会在苹果汁表面形成菌膜或在底部形成白色沉淀[3]；另一方面，酵母引起的腐败过程会产生二氧化碳，导致果汁胀包，降低产品的价值[4]。因此，探寻并实现能够对果汁中耐高渗酵母进行高效、安全控制的方法势在必行。

工业上常用热处理来确保食品的微生物安全性[5]，但过度的热处理可能会产生不良异味，尤其是对于苹果汁[6]。为了减少高温过程对食品品质的负面影响，非热灭菌技术应运而生，其是非常有应用前景的杀菌方式[7]。大气压低温等离子体作为一种新兴的非热灭菌技术，在食品行业中显示出了巨大的应用潜力[8-9]。研究表明，低温等离子体可产生活性氧、活性氮和臭氧等高活性物质[10]，这些活性物质使等离子体能够有效地灭活苹果[11]、草莓[12]、沙拉叶[13]、肉[14-15]等食品表面的污染微生物（产孢和腐败/致病微生物）。

然而，由于大气压低温等离子体的穿透能力较低，常用的介质阻挡放电（dielectric-barrier discharge，DBD）等离子体和常压等离子体射流（atmospheric pressure plasma jet，APPJ）仅适用于食品表面小区域的微生物灭活，难以作用于食品内部[8]。因此，探寻一种能够大批量、高效率、简单易行的等离子体处理食品的方法很有必要。沿面放电等离子体反应器可通过气泡直接将活性物质注入液体中，使活性物质与待处理的液体能够快速接触，这将使液体食品中微生物迅速失活[16]。相对DBD等离子体和APPJ而言，沿面放电等离子体具有较高的处理速度和较强的处理能力，已被证明能够成功降解水中的苯酚[17]。因此，采用沿面放电等离子体处理可能是苹果汁工业中灭活耐高渗酵母的一种可行方法。

本研究的目的是通过沿面放电等离子体处理苹果汁，评估苹果汁中耐高渗酵母的杀灭效果，并研究沿面放电等离子体处理对苹果汁品质的影响。选择耐高渗酵母LB作为目标菌株，确定不同的放电电压、气体流速等工艺参数对灭活效果的影响。通过扫描电子显微镜（scanning electron microscopy，SEM）研究灭活过程中耐高渗酵母的结构变化，分析耐高渗酵母的失活机制和沿面放电等离子体处理对苹果汁主要的理化指标（pH值、可溶性固形物质量分数（soluble solids content，SSC）、可滴定酸（titratable acid，TA）质量浓度和还原糖质量浓度）及果汁色泽和挥发性化合物的影响，为沿面放电等离子体在苹果汁工业中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、菌株与试剂

‘红富士’（Malus domesticaBorkh. cv. Red Fuji）苹果，购于陕西杨凌，9月中下旬采摘，大小均一、无机械损伤、无病害或腐烂。

耐高渗酵母菌株Zygosaccharomyces rouxiiLB（B-WHX-12-54）（GenBank登录号KC544459）分离自陕西苹果汁。

葡萄糖 国药集团化学试剂有限公司；琼脂粉上海源叶生物科技有限公司；蛋白胨 上海中秦化学试剂有限公司；3-辛醇（纯度＞98%）标准品 日本东京化成工业株式会社；氯化钠（分析纯） 四川西陇化工有限公司；其他化学试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

QP 2010系列GC-MS气相色谱-质谱联用仪 日本岛津公司；PANTONE X-rite Ci7600色差分析仪 美国爱色丽公司；Nova Nano SEM 450扫描电子显微镜 美国FEI公司；雷磁PHS-3C型pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司；PAL-1型数显折光仪 日本ATAGO公司；GTR16-2型高速冷冻离心机 北京时代北利离心机有限公司。

1.3 方法

1.3.1 苹果汁的制备

将耐高渗酵母菌株转移到150 mL酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养液（yeast extract peptone dextrose medium，YPD）中，在（28.0±0.1）℃下摇床振荡培养（120～130 r/min）48 h，之后将培养液3 000 r/min离心5 min，除去上清液，用无菌蒸馏水洗涤两次。然后将所得酵母细胞重悬于无菌蒸馏水中，使最终细胞浓度为107～108CFU/mL。苹果去皮榨汁并过滤，在冷藏条件下备用。处理时将耐高渗酵母接种到每个苹果汁样品中，使每个苹果汁样品中耐高渗酵母的细胞浓度约为2×106CFU/mL。

1.3.2 沿面放电等离子体处理

沿面放电等离子体反应器系统示意图如图1所示。该系统由交流电源（0～21 kV、50 Hz）、等离子体发生器和处理室组成，与本课题组之前研究所用设备[18]类似，但有所修改。高压电极（即直径为1 mm的不锈钢弹簧）附着在圆柱形石英管的内壁上（内径12 mm、管壁厚1 mm），处理器内苹果汁被用作接地电极，沿该石英管的长轴方向进行沿面放电。使用硅胶干燥后的空气作为载气，以最大程度地降低加工成本并防止短路。处理过程中气体由体积流量计控制流量，并通过曝气器注入苹果汁中进行处理，处理量为500 mL。

图1 沿面放电等离子体反应器系统示意图Fig. 1 Schematic diagram of surface discharge plasma reactor system

固定气体流速为150 L/h，利用不同峰值放电电压（11、15、18、21 kV）的沿面放电等离子体处理苹果汁30 min，研究放电电压对耐高渗酵母杀灭的效果。固定峰值放电电压为21 kV，利用不同气体流速（60、100、150、200、300 L/h）的沿面放电等离子体处理苹果汁30 min，研究气体流速对耐高渗酵母杀灭的效果。

1.3.3 微生物计数

在沿面放电等离子体处理前后分别采集果汁样品，并使用YPD平板在（28.0±0.1）℃下孵育72 h，采用细胞计数法测定微生物数量，所有测定重复3 次。并通过lg（N/N0）（N0是微生物的初始数量/（CFU/mL），N是经沿面放电等离子体处理后的存活微生物数量/（CFU/mL））与处理时间的关系绘制微生物存活曲线。

1.3.4 扫描电子显微镜观察

将样品在体积分数2.5%戊二醛溶液中固定2 h，在pH 6.8的0.1 mol/L磷酸盐缓冲液中分别洗涤5、10、15、20、25 min和30 min，然后使用体积分数1%锇酸溶液固定2 h。再次用磷酸盐缓冲溶液冲洗，将盖玻片以体积分数30%、50%、70%、80%和90%的乙醇溶液脱水10 min，最后在100%乙醇中脱水2 次，每次时间10 min。

1.3.5 理化指标的测定

使用pH计测定果汁的pH值，并用折光仪测定果汁中SSC。TA质量浓度参照SB/T 10203—1994《果汁通用试验方法》进行测定，按式（1）计算。还原糖质量浓度使用3,5-二硝基水杨酸法测定[19]，所有测定重复3 次。

式中：V1为样品滴定所消耗氢氧化钠标准溶液体积/mL；V0为蒸馏水代替样品溶液所消耗氢氧化钠标准溶液体积/mL；c为氢氧化钠标准溶液浓度/（mol/L）；m为样品质量/g；V为吸取样品的体积/mL；K为果汁中相应酸的换算系数（苹果酸为0.067）。

1.3.6 色泽参数的测定

颜色是反映新鲜度和品质的指标，会影响消费者的购买决定。使用色差分析仪对苹果汁色泽进行测定。使用白色校准板进行校准。在白色背景下测定L*值（亮度）、a*值（红绿度）和b*值（黄蓝度），所有测定重复3 次。根据式（2）～（4）分别计算总色差（ΔE*ab）、色相角（h）和色度（C*）[20]。利用ΔL*、Δa*和Δb*值对等离子体处理前后苹果汁颜色的差异进行定量，其中总色差ΔE*ab表示颜色变化的幅度，色度C*为饱和度指数，色相角h为颜色外观的参数。

1.3.7 挥发性化合物分析

挥发性化合物的富集：采用顶空固相微萃取的方式富集挥发性化合物。吸取5 mL苹果汁样品注入20 mL进样瓶中，然后将3-辛醇（终质量浓度0.2 μg/L）作为定量内标加入进样瓶中。添加NaCl（2 g）于进样瓶，以抑制酶降解并促进挥发物向顶空释放。首先将进样瓶在45 ℃下平衡30 min，然后将50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头暴露于顶空中30 min以收集分析物[21]。

质谱条件：电子电离源的电子能量为70 eV，进样器、接口和离子源温度分别为250、230 ℃和230 ℃，质量扫描范围m/z为35～500。以氦气为载气，不分流进样流速为1.0 mL/min。温度程序设置为：40 ℃下保持3 min，以4 ℃/min的速率升至120 ℃，再以6 ℃/min的速率升至260 ℃，并保持9 min。

挥发性物质的定性及定量：参考质谱数据库（NIST 14和NIST 14s），采用匹配度和保留时间对挥发物进行定性。由于每个测试具有相同质量浓度的3-辛醇（定量内标），可通过式（5）计算每个苹果汁样品中香气物质的质量浓度。

式中：S*为内标的峰面积；S为各成分的峰面积；ρ*为内标质量浓度/（μg/L）。

1.4 数据处理与分析

所有实验重复进行3 次。采用SPSS软件进行方差分析和Duncan多重范围检测分析数据显著性差异，以P＜0.05表示数据差异显著。

2 结果与分析

2.1 放电电压对耐高渗酵母杀灭的效果

图2为耐高渗酵母在不同峰值放电电压（11、15、18、21 kV）沿面放电等离子体处理下的存活曲线。在处理过程中，所有苹果汁中的酵母细胞的数量都有所降低。放电电压为11 kV时，经30 min等离子体处理后，耐高渗酵母细胞数量降低了2.27 个对数；在15、18 kV和21 kV的放电电压下处理30 min，耐高渗酵母细胞数量降低了2.90、3.39 个和5.60 个对数。当放电电压从11 kV升高到21 kV时，对果汁中耐高渗酵母的杀灭效果增强。这可能是由于所产生的电子在相对高的放电电压下被较高强度的电场加速，因此具有更高的能量并且可以产生更多的自由基和带电粒子，从而对微生物杀灭效果更好[21-22]。目前常用的APPJ一般通过喷嘴以点对点的形式处理样品，适用于处理不均匀的小区域；而对于DBD等离子体处理，电极间距越小，等离子体通道越易形成，因此放电间隙大多为毫米级，适宜处理薄层样品[9]。对比DBD等离子体，沿面放电等离子体可将苹果汁的处理量从3 mL[23]提高到500 mL，极大地提升了处理能力。

图2 在不同放电电压下耐高渗酵母的存活曲线Fig. 2 Survival curves of Z. rouxii LB under different discharge voltages

2.2 气体流速对耐高渗酵母杀灭的效果

图3为不同气体流速（60、100、150、200、300 L/h）下等离子体处理对苹果汁中耐高渗酵母的杀灭效果。结果表明，气体流速60 L/h和150 L/h下处理30 min时，耐高渗酵母细胞数量分别降低了3.28 个和5.59 个对数。当气体流速从150 L/h提高到300 L/h时，在相同的处理条件下，耐高渗酵母耐高渗酵母细胞数量分别降低了5.59 个和3.80 个对数，杀灭效果降低了32%。使用空气作为工作气体时，随着气体流速从60 L/h增加到300 L/h，沿面放电等离子体对苹果汁中的耐高渗酵母的杀灭效果先提升后而降低。这可能是气体流速的变化导致等离子体中活性物质浓度和种类出现差异，从而影响了耐高渗酵母的灭活效果。Li Qing等在对毛细管射流等离子体的研究中也发现了类似的趋势，在气体流速接近7 L/min时获得射流等离子体的最大强度，进一步增加气体流速会导致活性物质的强度降低，这可能是气体“吹脱”效应导致的[24]。

图3 在不同气体流速下耐高渗酵母的存活曲线Fig. 3 Survival curves of Z. rouxii LB under different air flow rates

2.3 沿面放电等离子体处理对耐高渗酵母形态和结构的影响

根据上述实验所得结果，选择杀灭效果最优的处理条件（电压21 kV及气体流速150 L/h）对样品进行处理，并通过SEM对耐高渗酵母进行观察，研究等离子体处理对耐高渗酵母形态和结构的影响。处理前的耐高渗酵母细胞（图4A）显示出典型的椭圆形状，具有光滑的表面和连续的细胞壁。沿面放电等离子体处理后，细胞形成孔状和收缩的形态（图4B），并且在SEM图像中可以看到酵母完整的细胞壁被破坏（图4C），细胞内组分从细胞质中泄漏，导致细胞死亡。上述结果表明苹果汁中耐高渗酵母的杀灭是通过破坏细胞壁并使细胞内组分泄漏完成的。Xiang Qisen等在使用DBD等离子体处理酵母时也发现，经等离子体处理后细胞表面产生皱缩和穿孔，并伴有细胞内物质的释放[23]。这可能是由于沿面放电等离子体产生电穿孔、冲击波和各种活性物质（包括H2O2、O3和·OH等），能够在耐高渗酵母细胞中引起细胞膜的破裂损伤，从而灭活微生物[22]。

图4 最优处理条件下苹果汁中耐高渗酵母的SEM图像（×50 000）Fig. 4 Scanning electron microscopic images of Z. rouxii LB in apple juice processed under the optimal conditions (× 50 000)

2.4 沿面放电等离子体处理对苹果汁理化指标的影响

表1显示了沿面放电等离子体的处理对苹果汁pH值、TA质量浓度、SSC和还原糖质量浓度的影响。在处理前后，苹果汁中的SSC、可滴定酸质量浓度和还原糖质量浓度没有显著的变化（P＞0.05）。这与用DBD等离子体处理苹果汁的研究结果[23,25]相似。

表1 沿面放电等离子体处理对苹果汁理化指标的影响Table1 Physicochemical indexes of apple juice subjected to surface discharge plasma treatment

虽然处理前后苹果汁的pH值略有增加，但总体pH值保持在3.87～4.00。在用空气DBD等离子体处理苹果汁的研究中发现，处理40 s后苹果汁的pH值略微降低[25]。然而用氩气和0.1%氧气等离子体射流处理480 s后，苹果汁的pH值略有增加[26]。Dasan等使用等离子体射流处理苹果汁120 s，在处理前后苹果汁的pH值没有显著差异[27]。各研究中pH值的变化不同可能是使用不同的处理设备产生活性物质的数量和种类均有差异所致[25]。

2.5 沿面放电等离子体处理对苹果汁色泽的影响

表2为沿面放电等离子体处理对苹果汁的色泽的影响。沿面放电等离子体处理30 min后，苹果汁的L*值从52.81增加到65.21，表明样品变澄清。色度C*值从51.54降至37.00，表明苹果汁颜色变得不饱和。色相角h代表苹果汁的特征颜色，该参数从61.83°增加到87.10°；根据颜色进行分析，黄色对应90°，红色对应0°，而等离子体处理后苹果汁的色相角从红色值向黄色值移动。尽管色相角h改变，但处理过的果汁颜色仍在苹果汁的预期颜色范围内[28]。处理前后苹果汁a*值和b*值下降，这可能是沿面放电等离子体处理期间由活性物质诱导的有色颜料异构化或氧化反应所致[29]。

表2 沿面放电等离子体处理对苹果汁颜色的影响Table2 Color indexes of apple juice treated by surface discharge plasma

随着等离子体处理时间的延长，ΔE*ab显著增加（P＜0.05）。沿面放电等离子体在21 kV下处理10、20 min和30 min时苹果汁ΔE*ab分别为16.47、20.95和27.03，与未处理的样品相比具有明显的颜色差异。

2.6 沿面放电等离子体处理对苹果汁挥发性化合物的影响

苹果汁中的挥发性化合物成分很多，并且由于苹果的香气特性，挥发性化合物的鉴定非常复杂。已确定某些挥发性化合物是苹果汁香气最重要的组成成分，例如己酸丁酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯、丁酸甲酯、乙酸己酯、1-己醛[30]。除了气味活性值较高的化合物外，其他气味活性值较低的化合物，例如乙醛、2-甲基-1-丁醇和1-己醇也起着重要作用[30]。

表3比较了处理前后样品中主要挥发性化合物的质量浓度，以确定沿面放电等离子体处理对苹果汁香气的影响。与未经处理的样品相比，处理后苹果汁中的大部分醇、酯、醛和酮的质量浓度无统计学差异（P＞0.05）。在醇类化合物中，除辛醇外，乙醇、2-甲基-1-丙醇、2-甲基-1-丁醇等作为苹果汁风味的重要组成部分，经过沿面放电等离子处理后质量浓度没有显著变化。在酯类物质中，除了乙酸乙酯和1-丁醇-3-甲基-乙酸酯质量浓度变化较明显外，几乎所有的挥发性化合物都保留了下来。

表3 沿面放电等离子体处理对苹果汁挥发性化合物的影响Table3 Volatile compounds of apple juice treated by surface discharge plasma

3 结 论

本研究采用沿面放电等离子体对苹果汁中耐高渗酵母进行杀灭。结果表明，沿面放电等离子体以21 kV的放电电压和150 L/h的气体流速处理500 mL苹果汁30 min会导致苹果汁中耐高渗酵母细胞数量减少5.60 个对数。SEM显示沿面放电等离子体处理过程中耐高渗酵母细胞结构受损，这可能是苹果汁中微生物被灭活的直接原因。沿面放电等离子体处理后，苹果汁的pH值仅略微增加，而SSC、可滴定酸质量浓度和还原糖质量浓度并没有显著变化（P＞0.05）。沿面放电等离子体处理会导致苹果汁的颜色发生显著变化，使L*值和ΔE*ab增加，令苹果汁变得更黄更澄清。此外，苹果汁中挥发性化合物的主要成分质量浓度没有发生显著变化（P＞0.05）。综上，沿面放电等离子体可以有效的杀灭苹果汁中的耐高渗酵母，并能保持苹果汁的理化指标和香气。本研究对沿面放电等离子体灭活苹果汁中耐高渗酵母的应用进行了初探，发现不同的基质会导致不同的灭活效果，故在浓缩苹果汁及其他液体食品的处理中需要进一步研究以优化处理条件，并评估沿面放电等离子体处理对食品基质中VC和其他营养成分的影响，以获得最佳的工业应用效果。