刘晓蓓，马 娟，牛 博，李 晋，常 剑，刘 鹏，陈 婷，刘 硕，黄 荣

（1新疆医科大学第五附属医院CT核磁室，乌鲁木齐 830054；2新疆医科大学第一附属医院神经外科，乌鲁木齐 830011；3新疆医科大学第五附属医院神经外科，乌鲁木齐 830054）

脑卒中是世界上严重危害人类的健康问题之一[1-2]，已成为发展中国家死亡和致残的首要原因[3]。近年来我国脑卒中患者逐渐趋于年轻化，伤残人数持续上升，社会压力和负担加剧[4]。脑卒中发病机制复杂、参与因素众多。当前对缺血性脑卒中（又称脑梗死）发病机制和致损原因并不完全清楚，仍需要大量研究。近年来缺血再灌注（ischemiareperfusion，I/R）导致的脑组织损伤受到大量研究者的关注[5-7]。目前人们对于再灌注损伤仍旧很模糊，而I/R引起的氧化应激、炎症、细胞凋亡等都在再灌注损伤过程中发挥重要作用[8-10]。

miRNA是一类由18～23个核苷酸组成的非编码RNA，广泛存在生物体内。miRNA在进化上高度保守，其表达具有组织特异性和时效性。miRNA具有基因转录后调控活性，在各类生物学过程中发挥重要作用[11]。研究发现miRNA在脑血管疾病[12-13]和中枢神经系统损伤[14-15]的发生发展过程中同样发挥重要作用。有研究指出，miRNA参与调控机体再灌注损伤过程[16-18]。

本研究构建了I/R动物模型，通过检测miR-34b-3p的表达分析其对脑梗死损伤和氧化应激的影响。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及细胞 SPF级雄性SD大鼠，10～13周龄，体质量200～240 g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司。恒温20～25℃，湿度50～70%，明暗各12 h，自由饮水摄食。所有实验符合伦理学要求。大鼠中枢神经细胞B35购自美国模式培养物典藏中心（ATCC），使用含10%胎牛血清的DMEM培养液于37℃、5%CO2条件下培养。

1.1.2 主要试剂 DMEM培养基、胎牛血清（Gibco）；miR-34b模拟物miR-34b-3p mimics、对照模拟物mimics-NC、miR-34b抑制物miR-34b-3pinhibitor、对照抑制物inhibitor-NC、Keap1干扰片段si-Keap1、对照干扰片段si-NC（上海吉玛）；miR-34b过表达慢病毒（湖南讴睿）；2,3,5-三苯基氯化四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）染料、3-硝基酪氨酸（3-nitrotyrosine，3-NT）和一氧化氮(nitric oxide,NO)检测试剂盒（上海生工），总超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和锰超氧化物歧化酶（manganese superoxide dismutase，MnSOD）检测试剂盒（南京建成）；双萤光素酶报告基因检测试剂盒（Promega）；Keap1抗体、Nrf2抗体、HO-1抗体、GAPDH抗体（proteintech）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠大脑中动脉栓塞(MCAO)模型制备及分组参考文献[19]建立的MCAO模型制备脑缺血动物模型，1 h后进行再灌注，完成I/R动物模型制备。为检测I/R动物模型中miR-34b的表达，将30只SD大鼠随机分为5组（对照组、假手术组、I/R 1h组、I/R 4 h组、I/R 24 h组），每组6只。对照组不做任何处理；假手术组只手术不栓塞血管，手术24 h后处死大鼠；I/R组分别在再灌注1、4、24 h后处死大鼠。为检测过表达miR-34b对动物模型的影响，将18只SD大鼠随机分为3组（假手术组、pLVX-NC组、pLVXmiR-34b组），每组6只。假手术组不注射病毒，24 h后处死大鼠；另外两组大鼠脑部注射相应病毒，3 d后进行MCAO造模，再灌注后24 h处死大鼠。

1.2.2 神经功能行为学评价 参照Bederson评分方法[20]，对实验大鼠的神经功能进行评分。无任何损伤症状记“0”分；对侧前爪伸展障碍记“1”分；不转圈、伴有前爪屈曲对侧压抵抗记“2”分；向左转圈、伴有前爪屈曲对侧压抵抗记“3”分；行走中无自发活动或大鼠死亡记“4”分。

1.2.3 脑梗死体积测定 大鼠处死后取出大脑组织。置于-20℃冰箱，速冻20min。将大鼠脑组织切成薄片，使用质量分数2%的2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）溶液染色，37℃避光孵育30 min。弃去TTC染色液，4%的多聚甲醛固定24h。正常组织染色后呈红色，而缺血组织染色后呈苍白色。使用ImageJ1.41软件计算脑梗死体积。脑梗死体积=[左侧大脑半球面积-（右侧大脑半球面积-梗塞部分面积）]/左侧大脑半球面积×100%。

1.2.4 脑组织3-NT、NO、总SOD和MnSOD含量测定组织使用匀浆器研磨，离心后取上清液进行检测。细胞使用液氮反复冻融，离心后取上清进行检测。采用生化法测定脑组织和细胞中的总SOD活力、Mn-SOD活力和NO含量，ELISA法检测3-NT含量。

1.2.5 细胞模型制备及分组 为检测miR-34b-3p对细胞蛋白表达的影响，将B35细胞分为2组：mimics-NC（过表达对照组）和miR-34b-3pmimics（miR-34b-3p过表达组）。为检测Keap1过表达和干扰效率，将B35细胞分为4组：si-NC（干扰对照组）、si-Keap1（Keap1干扰组）、vector-NC（过表达对照组）、vector-Keap1（Keap1过表达组）。为检测Keap1对细胞氧化应激的影响，将B35细胞分为6组：对照组（不做处理）、H2O2组（200μm H2O2处理）、H2O2+vector-NC组、H2O2+vector-Keap1组、H2O2+si-NC组、H2O2+si-Keap1组。为检测Keap1参与miR-34b对细胞氧化应激的调控作用，将B35细胞分为4组：mimics-NC+vector-NC组、miR-34b-3pmimics+vector-NC组、mimics-NC+vector-Keap1组、miR-34b-3pmimics+Keap1组。

1.2.6 实时定量PCR（qPCR）使用TRIZOL法提取大鼠脑组织总RNA，其后使用U6-R和miR-34b-3p-RT引物分别反转录获得qPCR模板。PCR反应条件为：95℃2 min；95℃15 s、60℃30 s、72℃30 s，进行40个循环。使用2-ΔΔCT法计算基因相对表达量，实验所用引物序列信息见表1。

表1 引物序列信息

1.2.7 免疫印迹（Western Blot，WB）细胞裂解液溶解细胞收集蛋白，二喹啉甲酸（BCA）法检测蛋白浓度。配制十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝胶进行蛋白电泳。将凝胶中蛋白转移至聚偏氟氯乙烯（PVDF）膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1 h。相应一抗Keap1（1:2 000）、Nrf2（1:2 000）、HO-1（1:4 000）、GAPDH（1∶20 000）4℃孵育过夜。PBS洗涤后使用二抗（1∶10 000）室温孵育1 h。PBS洗涤后使用增强化学发光（ECL）液进行显色。使用ImageJ 1.41软件计算条带灰度值。

1.2.8 双萤光素酶报告基因分析 生物信息学预测发现miR-34b-3p序列可靶向结合Keap1的3'-UTR序列。将野生型或突变型Keap1 3'-UTR分别克隆至psiCHECK-2载体中，构建野生型报告基因（Wt-Keap1）和突变型报告基因（Mut-Keap1）。人肾上皮细胞（HEK293）使用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养，分为8组。将mimics-NC、miR-34b-3pmimics、inhibitor-NC、miR-34b-3pinhibitor分别与Wt-Keap1或Mut-Keap1共转染，进行萤光素酶活性分析。

1.3 统计学分析所有实验数据均以平均数±标准差(±s)表示，由SPSS17.0统计软件分析处理。格拉布斯准则去除逸出值后，行方差分析，两两比较使用LSD-t检验。对神经评分进行非参数统计。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠脑组织miR-34b-3p表达比较qPCR检测各组大鼠脑组织中miR-34b-3p的表达。结果显示：与对照组相比，假手术组无明显变化（P>0.05）；与假手术组相比，I/R 1h组miR-34b-3p表达降低（P<0.05），I/R 4h组和I/R 24h组miR-34b-3p表达降低（P<0.01），见表2。

表2 大鼠脑组织miR-34b-3p表达比较(±s)

表2 大鼠脑组织miR-34b-3p表达比较(±s)

注：与假手术组相比，△P<0.05，△△P<0.01。

分组对照组假手术组I/R1 h I/R4 h I/R24 h miR-34b-3p 1.001±0.101 0.987±0.104 0.776±0.087△0.587±0.066△△0.306±0.021△△

2.2 注射p LVX-miR-34b后大鼠脑组织miR-34b-3p表达变化比较qPCR结果显示，注射pLVX-miR-34b后大鼠脑组织miR-34b-3p的表达升高（P<0.01），见表3。神经功能评分结果显示，注射pLVXmiR-34b后再灌注后1 h、4 h、24 h神经功能评分均降低（P均<0.05），见表4。2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色结果显示，注射pLVX-miR-34b后大鼠脑梗死体积减少（P<0.01），见图1和表5。

表5 大鼠脑组织脑梗死体积百分比比较(±s)

表5 大鼠脑组织脑梗死体积百分比比较(±s)

注：与pLVX-NC组相比，△△P<0.01。

分组pLVX-NC pLVX-miR-34b脑梗死体积百分比/%50.0±4.0 29.3±4.7△△

图1 大鼠脑组织TTC染色结果

表3 大鼠脑组织miR-34b-3p表达比较(±s)

表3 大鼠脑组织miR-34b-3p表达比较(±s)

注：与pLVX-NC相比，△△P<0.01。

分组pLVX-NC pLVX-miR-34b miR-34b-3p 1.000±0.114 3.096±0.134△△

表4 大鼠脑组织神经功能评分比较(±s)

表4 大鼠脑组织神经功能评分比较(±s)

注：与pLVX-NC组相比，△P<0.05，△△P<0.01。

分组pLVX-NC pLVX-miR-34b神经功能评分I/R1 h 4.00±0.00 3.33±0.52 I/R4 h 3.17±0.75 1.5±054△△I/R24 h 2.33±0.52 1±0.00△

2.3 各组大鼠脑组织氧化应激标志物水平比较标志物检测结果显示，与假手术组相比，pLVX-NC组NO和3-NT含量升高（P<0.01，P<0.01），总SOD和MnSOD含量降低（P<0.01，P<0.01）；与pLVX-NC组相比，pLVX-miR-34b组NO和3-NT含量降低（P<0.01，P<0.01），总SOD与MnSOD含量升高（P<0.01，P<0.05），见表6。

表6 大鼠脑组织miR-34b-3p表达比较(±s)

表6 大鼠脑组织miR-34b-3p表达比较(±s)

注：与假手术组相比，△P<0.05，△△P<0.01；与pLVX-NC组相比，▲P<0.05，▲▲P<0.01。

分组假手术组pLVX-NC pLVX-miR-34b NO（nmol/g）51.40±6.19 85.87±4.64△△66.30±4.01△▲▲3-NT（pg/μg）233.33±15.04 358.00±23.64△△215.67±18.61▲▲Total SOD（U/mg prot）146.70±4.86 89.63±6.81△△118.33±7.66△△▲▲MnSOD（U/mg prot）71.20±6.12 35.20±1.97△△51.0±2.15△△▲

2.4各组大鼠脑组织和B35细胞Keap1/Nrf2/HO-1信号通路蛋白表达比较大鼠脑组织WB结果显示，与假手术组相比，pLVX-NC组Keap1表达降低，Nrf2和HO-1表达升高（P<0.01，P<0.01，P<0.01）；与pLVX-NC组相比，Keap1表达降低，Nrf2和HO-1表达升高（P<0.01，P<0.01，P<0.01），见图2A和表7。B35细胞WB结果显示，与mimics-NC组相比，miR-34b mimics组Keap1表达降低，Nrf2和HO-1表达升高（P均<0.01），见图2B和表8。

表7 大鼠脑组织信号通路蛋白表达比较(±s)

表7 大鼠脑组织信号通路蛋白表达比较(±s)

注：与假手术组相比，△△P<0.01；与pLVX-NC组相比，▲▲P<0.01。

分组假手术组pLVX-NC pLVX-miR-34b Keap1 1.010±0.066 0.567±0.114△△0.267±0.047△△▲▲Nrf2 1.010±0.066 1.707±0.059△△2.363±0.196△△▲▲HO-1 1.040±0.040 2.043±0.172△△2.750±0.151△△▲▲

表8 B35细胞信号通路蛋白表达比较(±s)

表8 B35细胞信号通路蛋白表达比较(±s)

注：与mimics NC组相比，△P<0.05；△△P<0.01。

分组mimicsNC miR-34b-3pmimics Keap1 1.000±0.095 0.397±0.064△△Nrf2 1.000±0.073 1.488±0.156△HO-1 1.000±0.112 2.084±0.244△△

图2 Keap1/Nrf2/HO-1信号通路蛋白表达检测结果

2.5 各组细胞Keap1萤光素酶活性比较双萤光素酶报告基因结果显示，转染WtKeap1的各组细胞中，与mimics-NC组相比，miR-34b-3pmimics组萤光素酶活性降低（P<0.01）；与inhibitor-NC组相比，miR-34b-3pinhibitor组萤光素酶活性升高（P<0.01）。转染MutKeap1的各组细胞萤光素酶活性均无明显变化（P>0.05），见表9。

表9 相对萤光素酶活性比较(±s)

2.6 过表达和干扰Keap1后B35细胞氧化应激标志物水平比较WB结果显示，与si-NC组相比，si-Keap1组Keap1表达降低（P<0.01）；与vector-NC组相比，vector-Keap1组Keap1表达升高（P<0.01），见图3和表10。标志物检测结果显示，与NC组相比，H2O2组NO和3-NT含量升高（P<0.01，P<0.01），总SOD和MnSOD含量降低（P<0.01，P<0.01）；与H2O2+vectorNC组相比，H2O2+vector-Keap1组NO和3-NT含量升高（P<0.01，P<0.01），总SOD和MnSOD含量降低（P<0.01，P<0.01）；与H2O2+si-NC组相比，H2O2+si-Keap1组NO和3-NT含量降低（P<0.05，P<0.05），组总SOD和MnSOD含量升高（P<0.05，P<0.05），见表11。

表11 B35细胞氧化应激标志物水平比较(±s)

表11 B35细胞氧化应激标志物水平比较(±s)

注：与对照组相比，△P<0.05，△△P<0.01；与H2O2+vector-NC组相比，▲▲P<0.01；与H2O2+si-NC相比，*P<0.05。

分组对照组H2O2 H2O2+vector-NC H2O2+vector-Keap1 H2O2+si-NC H2O2+si-Keap1 NO 1.000±0.109 1.609±0.138△△1.524±0.098△△2.161±0.220△△▲▲1.479±0.125△△1.214±0.085*3-NT 1.000±0.093 1.351±0.107△△1.248±0.165△1.605±0.073△△▲▲1.313±0.088△△1.129±0.084*Total SOD 1.000±0.118 0.596±0.062△△0.646±0.086△△0.397±0.043△△▲▲0.644±0.084△△0.817±0.065*MnSOD 1.000±0.130 0.671±0.058△△0.699±0.068△△0.406±0.012△△▲▲0.711±0.077△△0.917±0.052*

图3 Keap1的干扰及过表达验证结果

表10 B35细胞Keap1蛋白表达比较(±s)

表10 B35细胞Keap1蛋白表达比较(±s)

注：与si-NC组相比，△△P<0.01；与vcetor-NC组相比，▲▲P<0.01。

分组si-NC si-Keap1 vcetor-NC vector-Keap1 Keap1 1.030±0.110 0.300±0.065△△0.999±0.074 2.203±0.324▲▲

2.7 各组B35细胞氧化应激标志物水平比较标志物检测结果显示，与mimics NC+vector-NC组相比，miR-34b-3p过表达组NO和3-NT含量降低（P<0.01，P<0.01），总SOD和MnSOD含量升高（P<0.01，P<0.01），Keap1过表达组NO和3-NT含量升高（P<0.01，P<0.01），总SOD和MnSOD含量降低（P<0.01，P<0.01）；与Keap1过表达组相比，miR-34b-3p和Keap1共表达组NO和3-NT含量降低（P<0.01，P<0.01），总SOD和MnSOD含量升高（P<0.01，P<0.01），见表12。

表12 B35细胞氧化应激标志物水平比较(±s)

表12 B35细胞氧化应激标志物水平比较(±s)

注：与mimics NC+vector-NC组相比，△P<0.05，△△P<0.01；与mimics NC+vector-Keap1组相比，▲▲P<0.01。

分组mimicsNC+vector-NC miR-34b-3p mimics+vector-NC mimicsNC+vector-Keap1 miR-34b-3pmimics+vector-Keap1 NO（nmol/g）80.27±5.00 52.53±4.20△△130.73±7.90△△71.56±3.70▲▲3-NT（pg/μg）367.03±14.57 279.23±10.82△△411.40±11.53△△333.30±10.21▲▲Total SOD（U/mg prot）87.36±12.91 135.10±6.91△△64.07±5.08△△115.67±6.05△△▲▲MnSOD（U/mg prot）38.43±2.11 61.17±2.14△△27.60±2.93△△45.27±3.84△▲▲

3 讨论

众多研究显示，I/R介导的氧化应激是导致神经细胞和神经元损伤的重要原因[21-22]。本研究发现，miR-34b-3p在I/R介导的氧化应激中发挥重要作用。过表达miR-34b-3p抑制氧化应激，对脑神经细胞产生保护作用，而Keap1蛋白及Nrf2/ARE信号通路参与了该调控过程。

miR-34b已被证明在大脑发育过程中发挥重要功能[23]。近年来，miR-34b被报道在铅神经毒性大鼠模型和帕金森患者脑组织中表达异常[24-25]，提示miR-34b可能参与脑神经损伤过程。在本研究中，I/R大鼠模型脑组织miR-34b-3p表达持续降低，而过表达miR-34b-3p可降低脑梗死体积、神经功能评分，表明miR-34b-3p参与I/R损伤调控，是I/R损伤调控中的保护性因素。氧化应激损伤是I/R发生后脑部组织受损的主要原因，NO和3-NT含量可揭示I/R损伤中活性氮簇的活性强弱，总SOD和MnSOD含量可反映脑组织受到氧化损伤的程度。本研究发现，过表达miR-34b-3p可降低NO和3-NT含量，升高总SOD和MnSOD含量，表明miR-34b-3p可减轻动物和细胞氧化应激。已有研究报道miR-34b参与氧化应激。在人神经母细胞瘤细胞和小鼠原代皮层神经元中，miR-34b/c控制活性氧的产生，影响线粒体氧化应激[26]。而在帕金森症中，miR-34b/c早期失调触发线粒体功能障碍和氧化应激，进而使下游转录组发生改变[27]。

MiRNA在哺乳动物中发挥功能的机制主要为与靶基因3'-UTR结合，缩短靶mRNA半衰期或抑制靶mRNA翻译[28]。在本研究中，生物信息学表明Keap1基因3'-UTR包含miR-34b-3p结合位点，提示miR-34b-3p可能靶向调控Keap1表达。双荧光素酶报告基因分析和WB检测结果表明，miR-34b-3p靶向结合Keap1基因3'-UTR序列并抑制Keap1蛋白表达。

Nrf2/ARE是机体调节氧化应激的重要通路，Nrf2是其中的关键因子[29]。Keap1是Kelch家族中的一员，是Nrf2的负调控因子[30]。通常情况下Keap1与Nrf2在细胞质中结合，抑制Nrf2激活，而长期未被激活的Nrf2会被泛素化进而降解。当机体受到刺激时，Nrf2被释放并转移到细胞核，激活下游基因转录。HO-1是机体内的抗氧化剂，受到Nrf2调控[31]。在本研究中，H2O2介导的氧化应激损伤细胞结果表明，Keap1能增强细胞氧化应激，而降低Keap1表达是减轻氧化应激的有效途径。进一步采用过表达Keap1联合过表达miR-34b-3p处理细胞，结果显示联合过表达组氧化应激减轻，表明miR-34b-3p通过降低Keap1表达减轻氧化应激。此外，miR-34b-3p在体内体外均可使Keap1表达降低，使Nrf2和HO-1表达升高，表明miR34b-3p可能通过Keap1调控Nrf2/ARE信号通路，进而减轻氧化应激。

综上所述，本研究表明，miR-34b-3p通过调控Keap1表达抑制氧化应激，保护脑神经细胞。本研究为氧化应激调控机制研究提供了一定的理论基础。