傅宝尚，丁若松，尚 珊，董秀萍，祁立波, ，于 波

（1.大连工业大学食品学院，国家海洋食品工程技术研究中心，辽宁大连 116034；2.辽渔集团有限公司，辽宁大连 116000）

鱿鱼，也称柔鱼，属于软体动物门，头足纲，经常成群活动于浅海中上层，垂直移动范围达百余米[1]。鱿鱼具有生命周期短、繁殖能力强、资源丰富、营养价值高等特点，是一种高蛋白、低脂肪、深受人们喜爱的水产品[2]。鱿鱼广泛分布于大西洋、印度洋和太平洋海域，是世界上三大未充分开发利用并且具有很大潜力的海洋生物资源之一[3]。20世纪80年代以来，远洋鱿钓渔业成为我国远洋渔业的重要组成部分。目前鱿鱼已是我国捕捞产量的产业之一，根据最新渔业年鉴统计，2020年我国国内鱿鱼年捕捞量达29.8万吨[4]，约占世界鱿鱼产量的21%。因此我国对鱿鱼食品的加工也逐渐深入，调味鱿鱼丝，烤鱿鱼片，鱿鱼卤制品等产品也逐渐增多。

天然食品防腐剂因为其抑菌谱广、安全性高、热稳定性好等优点，近年来被广泛应用到食品中[5]，如纳他霉素、乳酸链球菌素、ε-聚赖氨酸盐等。食品加工中必不可少的一些化学合成防腐剂在食品加工中扮演着重要的角色[6]，如山梨酸钾、苯甲酸钠、四乙酸二钠等。根据GB 2760-2014《中华人民共和国国家标准 食品添加剂使用卫生标准》[7]要求：能使用在熟制水产品中的食品防腐剂、抗氧化剂主要有山梨酸钾、乳酸链球菌素、ε-聚赖氨酸盐、茶多酚、没食子酸丙酯。本研究选用了山梨酸钾、乳酸链球菌素、ε-聚赖氨酸盐这3种防腐剂，使用这3种防腐剂对鱿鱼进行处理，在37 ℃下进行贮藏，目的是让经过不同防腐剂处理的烤制鱿鱼产品处于高于正常水平的温度环境中，让产品加快变质速度，再通过理化检测实验对产品的变质情况进行评价来探究不同防腐剂对产品贮藏品质的影响。通过考察贮藏过程中烤制鱿鱼的TVB-N含量、菌落总数、pH、色泽的变化，并进行感官评价，探究不同防腐剂对烤制鱿鱼贮藏品质的影响，以期得出最佳防腐效果的防腐剂，为烤制鱿鱼加工提供参考，为产业化应用提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大连本地鱿鱼 学名中国枪乌贼（Uroteuthischinensis），冷冻品，550 g左右，采购于大连市仟和市场，−20 ℃贮藏待用；盐酸、硼酸 天津市大茂化学试剂厂；溴甲酚绿 北京宝希迪有限公司；氧化镁天津市科密欧化学试剂有限公司；甲基红 天津市化学试剂一厂；平板计数琼脂 青岛海博生物技术有限公司；乳酸链球菌素、ε-聚赖氨酸盐 伟日生物科技有限公司；山梨酸钾 安徽中弘生物工程有限公司。

Ultra Scan Pro型测色仪 美国Hunter Lab公司；K9840型自动凯氏定氮仪 海能仪器；T25DS25型匀浆机 德国IKA公司；SX-500型高压灭菌器日本TOMY公司；HPG-280HX型人工气候箱 东联电子技术开发有限公司；BJ-2CD型超净工作台上海博迅实业有限公司；SCC-WE101万能蒸烤箱德国Rational公司；S-3000 N扫描电子显微镜 日本Hitachi公司。

1.2 实验方法

1.2.1 原料预处理 鱿鱼原料流水解冻，去头足去皮去内脏，只取胴体肌肉用于各项保鲜指标和生物胺含量的测定。冲洗干净后切成大约3 cm×3 cm的小块。用电子天平称取四份，每份170 g。其中三份分别在0.025 g/kgε-聚赖氨酸盐溶液、0.5 g/kg乳酸链球菌素溶液、1 g/kg山梨酸钾溶液中浸泡30 min，另一份在蒸馏水中浸泡30 min，作为对照组。将上述4份鱿鱼样品放入4 ℃冰箱中贮藏2 h后放入40 ℃的烘箱中烘2.5 h，干燥结束后放入180 ℃烤箱烤3 min取出，装入包装袋中，每袋装20 g左右，用真空封口机封口，最后放入37 ℃烘箱中进行加速破坏实验，贮藏7 d，每隔一天取样测定各项指标。同时进行空白实验。

1.2.2 pH的测定 按照GB 5009.237-2016《食品安全国家标准 食品pH值的测定》[8]并进行相应调整：称取10 g剪碎的烤制鱿鱼样品，加入100 mL去离子水，用匀浆机在10000 r/min的条件下匀浆15 s，匀浆后静置浸渍30 min，过滤。取20 mL滤液用pH计测定pH。

1.2.3 色泽的测定 使用美国HunterLab公司Ultra-ScanPro型号的测色仪，每个样品测定6组平行。测定参数主要包括亮度值（Lightness，L*）、红度值（Redness，a*）和黄度值（Yellowness，b*）。L*表示亮度，L*=0，表示黑色；L*=100，表示白色；a*>0表示红度，相反则为绿度；b*>0表示黄度，相反则为蓝度[9]。

1.2.4 挥发性盐基氮（TVB-N）测定 按照GB 5009.228-2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮含量的测定》[10]并进行相应调整：称取剪碎的鱿鱼肉组织10 g，放入到50 mL的离心管中，加入15 mL去离子水，使用匀浆机在10000 r/min的条件下匀浆30~50 s，匀浆后将浆液倒入到100 mL的锥形瓶中，再向锥形瓶中补充85 mL的去离子水，浸提30 min后进行过滤，过滤后的液体于50 mL的离心管中进行离心，取上清液10 mL，上机进行测定。结果以每100 g样品中所含氮的毫克数表示，即用mg（N）/100 g来表示。

1.2.5 菌落总数（TVC）测定 检测前先称取25 g烤制鱿鱼用灭菌剪刀剪碎，置于无菌拍打袋中，加入浓度为0.85%的生理盐水225 mL，拍打1 min，制成1:10的样品匀液。按照GB 4789.2-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》[11]中的步骤对样品中的菌落总数进行测定。

1.2.6 微观结构测定方法 将烤制鱿鱼样品进行冷冻干燥处理后，沿着鱿鱼肌肉纤维的方向将冻干后的鱿鱼掰断，取断面完整的部分[12]，用手术刀修整为1 cm×0.5 cm×0.5 cm的小块，将样品断面朝上固定在载物台上，用扫描电子显微镜进行观察并拍照。

1.2.7 感官评价 参照GB/T 37062-2018《水产品感官评价指南》，制定出感官评价标准表。从食品专业的研究生中筛选出10人（5位男性，5位女性）组成感官评价小组，并对该小组成员进行培训。在品评的过程中不能互相交流，所有参评的样品采用3位数随机编码的方式进行编码。感官评价满分以十分计，各指标评价标准及分数见表1。

表1 烤制鱿鱼的感官评价标准Table 1 Sensory evaluation criteria of baked squid

1.3 结果统计方法

采用Origin 8.5进行处理论文中所有图表的绘制，并用Spssstatisticsl 16.0软件对实验结果进行差异显著性分析，P<0.05表示显著，P<0.01表示极显著[13]。

2 结果与分析

2.1 pH的变化

食品的pH能反映食品的酸碱性，也是评价食品品质的一个重要指标[14]。通过检测食品的pH，可以确保食品的品质并且能增加食品的稳定性，从而延长食品的保质期[15]。由图1可知，使用3种不同防腐剂处理的烤制鱿鱼和空白组烤制鱿鱼的pH随着贮藏时间的增长呈现上升的趋势。0~2 d时，ε-聚赖氨酸盐处理组、山梨酸钾处理组和空白组烤制鱿鱼的pH无显著性差异；第3~7 d时，空白组和ε-聚赖氨酸盐处理组烤制鱿鱼的pH明显高于山梨酸钾处理组，可能与此时期TVB-N含量的上升有关，TVB-N的本质主要是蛋白质分解产生的氨以及胺类等碱性含氮物质[16]，由此可见是因为空白组和ε-聚赖氨酸盐处理组烤制鱿鱼的蛋白质分解导致TVB-N含量的上升从而导致pH升高。在整个贮藏过程中，Nisin处理的烤制鱿鱼的pH始终明显低于ε-聚赖氨酸盐处理组、山梨酸钾处理组和空白组，这是因为Nisin本身呈酸性，其可以降低周围介质的pH[17]，这是Nisin处理组pH始终明显低于其他3组的主要原因。在整个贮藏期间，使用Nisin、山梨酸钾、ε-聚赖氨酸盐处理的烤制鱿鱼与空白组烤制鱿鱼的pH变化差值分别为0.43、0.50、0.70、0.79，由此可见，与其他组相比，Nisin处理的烤制鱿鱼在贮藏过程中pH变化最小，因此Nisin能有效减缓烤制鱿鱼pH的变化。

图1 不同防腐剂处理的烤制鱿鱼片在贮藏7 d内pH的变化Fig.1 Changes in pH of roasted fillets treated with different preservatives within 7 days of storage

2.2 色泽的变化

在贮藏过程中，脂肪氧化、蛋白质变性、色素降解等反应的发生会引起鱼肉色泽变化[18]。

通过测定鱼肉的L*，a*，b*值来表征烤制鱿鱼片颜色的变化。在不同防腐剂处理下烤制鱿鱼片的色度L*值如图2所示。从图中可以看出，随着贮藏时间的增长，使用3种不同防腐剂处理的烤制鱿鱼片和空白组烤制鱿鱼片的L*值随着贮藏时间的增长呈现下降的趋势，L*值不断降低说明鱿鱼肉质的光泽度在贮藏期间有所降低，贮藏初期颜色较为鲜亮到后期颜色略微暗淡，鱿鱼肉的可接受程度也逐渐降低。造成这种现象的原因可能是随贮藏时间的延长，肌红蛋白发生氧化生成高铁肌红蛋白，反而使亮度下降。故而L*值下降趋缓。这与卢芸等[19]研究结果一致。在整个贮藏过程中，ε-聚赖氨酸盐处理组烤制鱿鱼的L*值显著高于山梨酸钾处理组、乳酸链球菌素处理组和空白组，且山梨酸钾处理组烤制鱿鱼片的L*值与空白组无显著性差异，这说明ε-聚赖氨酸盐可以更好的减缓烤制鱿鱼片L*值的下降。ε-聚赖氨酸盐可用作为食品的护色剂，其对食品具有良好的保鲜及护色效果，还具有抗氧化、防止食品褐变的作用[20]。

图2 不同防腐剂处理的烤制鱿鱼片在贮藏7 d内色度L*值变化Fig.2 Changes of chroma L* values of roasted fillets treated with different preservatives within 7 days of storage

在不同保鲜剂处理下烤制鱿鱼片的色度a*值如图3所示。随着贮藏时间的增长，这3种不同防腐剂处理的烤制鱿鱼片和空白组烤制鱿鱼片的a*值呈现上升的趋势。在整个贮藏过程中，在贮藏的第0~2 d，3种不同防腐剂处理的烤制鱿鱼片的a*值无显著性差异；第3~7 d时4组烤制鱿鱼片的a*值均存在显著性差异，其中空白组烤制鱿鱼片的a*值增长速度最快，其次是山梨酸钾处理组和乳酸链球菌素处理组，ε-聚赖氨酸盐处理组烤制鱿鱼片的a*值增长速度最慢，可能的原因是ε-聚赖氨酸盐抑制烤鱿鱼片中高铁肌红蛋白的生成，这与田光娟[21]等人研究结果一致。所以本实验中ε-聚赖氨酸盐可以更好的减缓烤制鱿鱼片a*值的上升。

图3 不同防腐剂处理的烤制鱿鱼片在贮藏7 d内色度a*值变化Fig.3 Changes of chroma a* values of roasted fillets treated with different preservatives within 7 days of storage

在不同防腐剂处理下烤制鱿鱼片的色度b*值如图4所示。由图4可知，随着贮藏时间的增长，使用3种不同防腐剂处理的烤制鱿鱼和空白组烤制鱿鱼的b*值呈现上升的趋势，这表明鱿鱼随着贮藏期的延长，鱿鱼肉有发黄的趋势。黄卉[22]等人认为随着贮藏期的延长，在光线、温度、酶等引发剂的作用下鱼肉脂肪逐渐被氧化，使得肉逐渐变黄。0 d时，4组烤制鱿鱼的b*值无显著性差异，说明烤制鱿鱼片的脂质氧化与腐败程度对肌肉的颜色影响显著，各种防腐剂能有效及控制鱿鱼肌肉中的蛋白质分解[23]。在贮藏的1~7 d，ε-聚赖氨酸盐处理组烤制鱿鱼的b*值均显著低于其他3组，可能的原因是ε-聚赖氨酸盐阻止了烤制鱿鱼组织中的脂质过氧化[24]，又由于ε-聚赖氨酸盐能防止食品褐变，所以ε-聚赖氨酸盐可以更好的减缓烤制鱿鱼b*值的上升。在本实验中经ε-聚赖氨酸盐组处理的烤制鱿鱼片的b*值的变化速度要明显低于其他组。

图4 不同防腐剂处理的烤制鱿鱼片在贮藏7 d内色度b*值变化Fig.4 Variation of chroma b*value of roasted squid slices treated with different preservatives within 7 d storage

综上所述，在对不同防腐剂处理的烤制鱿鱼片色度值测定后发现，经ε-聚赖氨酸盐处理的烤制鱿鱼片色度值较其他四组效果好，说明ε-聚赖氨酸盐可以更好的抑制烤制鱿鱼片贮藏期间色泽的变化，保持烤制鱿鱼片具备良好的食用特性。

2.3 TVB-N的变化

挥发性盐基氮（TVB-N），是常用来判定肉制品新鲜与否的理化指标[25]。如图5所示，随着贮藏时间的增长，3种不同防腐剂处理以及空白组烤制鱿鱼的TVB-N含量呈现上升的趋势。这是因为微生物繁殖速度加快，腐败菌将蛋白质分解，产生的胺类等物质积累[26]。而使用乳酸链球菌素、山梨酸钾、ε-聚赖氨酸盐处理的烤制鱿鱼片的TVB-N初始值（0 d）相比于空白组处理的烤制鱿鱼片初始值均降低了82%、30%、24%，说明3种防腐剂均具备抑制烤制鱿鱼挥发性盐基氮生成的能力。并且在整个贮藏过程中，乳酸链球菌素处理的烤制鱿鱼片的TVB-N含量显著低于与其他3组，在贮藏的第7 d，乳酸链球菌素处理的烤制鱿鱼片的TVB-N含量分别比山梨酸钾组、ε-聚赖氨酸盐组、空白组降低了2.35、8.123、9.612。这是由于乳酸链球菌素处理组pH较低，抑制了微生物生长，从而降低肉中蛋白质分解的速度[27]，进而延缓肉的腐败，减缓烤制鱿鱼片 TVB-N值的增长。并且乳酸链球菌素处理组的TVB-N值在7 d贮藏过程没有超过国标规定值30 mg·100 g−1[28]，而ε-聚赖氨酸盐处理组和空白组烤制鱿鱼片的TVBN含量均超过国标规定的30 mg·100 g−1。与其他各组相比，乳酸链球菌素能更好的抑制烤制鱿鱼片TVB-N值的产生，减缓烤制鱿鱼片腐败变质的速度。

图5 不同防腐剂处理的烤制鱿鱼片在贮藏7 d内TVB-N含的变化Fig.5 Changes in TVB-N contents of roasted fillets treated with different preservatives within 7 days of storage

2.4 菌落总数的变化

烤制鱿鱼片在不同防腐剂处理下的微生物变化如图6所示。从此图中可以看出，随着贮藏时间的延长，空白组、添加ε-聚赖氨酸盐组、添加山梨酸钾组和添加乳酸链球菌素组在不同贮藏温度下的菌落总数值均呈显著增加趋势，并且各组之间差异明显。

图6 不同防腐剂处理的烤制鱿鱼片在贮藏7 d内菌落总数的变化Fig.6 Changes in the total number of colonies of roasted fillets treated with different preservatives within 7 days of storage

在贮藏的1 d，3种不同防腐剂处理以及空白组烤制鱿鱼片的菌落总数并无显著性差异，原因主要是高温烤制能起到灭菌的效果，且烤制鱿鱼片的包装紧密，能有效抑制微生物的生长速度[29]。在贮藏的第2~5 d，3种不同防腐剂处理的烤制鱿鱼片的菌落总数显著低于空白组烤制鱿鱼的菌落总数，且3种不同防腐剂处理的烤制鱿鱼片的菌落总数无显著性差异。在贮藏的第5~7 d，乳酸链球菌素处理的烤制鱿鱼片的菌落总数显著低于ε-聚赖氨酸盐处理组、山梨酸钾处理组和空白组。第6~7 d时，ε-聚赖氨酸盐处理组和空白组烤制鱿鱼片的菌落总数显著高于乳酸链球菌素和山梨酸钾处理组，且这2组烤制鱿鱼片的菌落总数无显著性差异。在整个贮藏过程中，空白组和山梨酸钾处理组烤制鱿鱼片的菌落总数在第5 d时超过国家标准，分别为4.59、4.48 lg CFU·mL−1；这可能是由于随着时间的延长，鱿鱼体自身发生一定的自溶反应，鱼体内的氨基酸和蛋白质进一步溶出，被微生物所利用[30]。ε-聚赖氨酸盐处理组烤制鱿鱼片的菌落总数在第6 d时超过国家标准，含量达到了5.08 lg CFU·mL−1。乳酸链球菌素处理组烤制鱿鱼片的菌落总数在贮藏过程中没有超过国家标准且后期菌落总数呈平缓趋势，并在整个贮藏期菌落总数均未超标，可能因为乳酸链球菌素能够有效抑制烤制鱿鱼中微生物的生长，延缓其生长的对数期[31]，降低菌落总数。综上所述，3种不同防腐剂中，乳酸链球菌素具备更好的抑菌效果。

2.5 微观结构的变化

图7 为3种不同防腐剂处理及空白组烤制鱿鱼在贮藏过程中的微观结构的变化。横排从左至右依次为空白组、山梨酸钾处理组、ε-聚赖氨酸盐处理组以及Nisin处理组，纵列从上至下依次为贮藏0、1、2、3、4、5、6、7 d的烤制鱿鱼。0 d时的烤制鱿鱼，结构较完整，整体结构趋于紧密，肌纤维致密均匀，纤维之间基本观察不到明显的间隙；但空白组的烤制鱿鱼断面不干脆，凹凸不平；而3种不同防腐剂处理的烤制鱿鱼断面较为平整；但4组样品断面的表面均能观察到一些断开的较零散的肌原纤维，可能是制样时采取掰断的操作所致。贮藏1~2 d时，4组烤制鱿鱼的肌纤维都出现了不同程度劣变，肌纤维之间可以观察到不明显的间隙，但空白组的烤制鱿鱼在2 d时肌纤维间出现了较为明显的间隙。贮藏3~5 d时，空白组烤制鱿鱼的的肌纤维间隙逐渐变大，肌纤维出现了断裂、分离以及扭曲的现象；山梨酸钾处理组和ε-聚赖氨酸盐处理组的烤制鱿鱼也出现了肌纤维断裂及分离的现象，且第5 d时可以观察到肌纤维间明显的间隙；Nisin处理组的烤制鱿鱼也可观察到肌纤维间存在明显的间隙，但观察不到明显的肌纤维断裂现象。贮藏6~7 d时，空白组的烤制鱿鱼劣变严重，肌纤维结构混乱，断裂的现象十分严重；山梨酸钾处理组和ε-聚赖氨酸盐处理组烤制鱿鱼的肌纤维间出现严重的分离现象，且肌纤维间间隙较大，7 d时山梨酸钾处理组的烤制鱿鱼的肌纤维也出现严重的断裂现象；Nisin处理组烤制鱿鱼的肌纤维可观察到轻微的断裂现象，肌纤维间间隙也略有增大，但与其他组相比，Nisin处理组烤制鱿鱼的微观结构较为完整。鱿鱼是典型的高蛋白生物，其肌纤维的主要成分为蛋白质，所以其微观结构发生变化的主要原因是蛋白质受到破坏[32]。鱿鱼内源酶或微生物的作用可使蛋白质分解被破坏，但鱿鱼经过高温烤制后，大部分内源酶被高温破坏失去活性[33]，所以本实验中烤制鱿鱼蛋白质被破坏主要与微生物的作用有关，中烤制鱿鱼贮藏过程中菌落总数、TVB-N含量和pH的变化情况能证实这一点，且烤制鱿鱼的菌落总数、TVB-N含量和pH的变化结果与烤制鱿鱼微观结构变化情况基本一致。

图7 不同防腐剂处理烤制鱿鱼37 ℃贮藏条件下微观结构的变化Fig.7 Changes of microstructure of roasted squid under 37 ℃ storage conditions treated with different preservatives

2.6 感官评价结果

产品在贮藏期间品质的变化可以用感官评分直观地反映出来。从表2可以看出,在贮藏第1 d时，乳酸链球菌素组、山梨酸钾组、ε-聚赖氨酸盐组的感官评分相近，随着贮藏时间延长，各组样品的感官品质均逐渐下降，但下降幅度不尽相同。对照组的感官得分下降最快，贮藏第3 d时，对照组的感官评分下降至2.23 分，产品出现异味，色泽变化较大，感官不能接受，表明产品开始腐败变质。这可能是因为蛋白质贮藏过程中，蛋白质和醛类相互作用导致蛋白质变性和聚集，使肉制品发生品质的变化。肉中脂肪发生氧化时，肉中的多不饱和脂肪酸、色素、脂溶性维生素减少，产生酸败味，从而影响肉制品的品质。而同一时间乳酸链球菌素处理的烤制鱿鱼的色泽、外观、气味及总体可接受性仍较好。山梨酸钾处理的烤制鱿鱼在贮藏第6 d达到不可接受范围；ε-聚赖氨酸盐组处理的烤制鱿鱼的感官得分在贮藏第5 d达到不可接受范围。可见，乳酸链球菌素能在一定程度上延缓烤制鱿鱼感官品质下降，较好的保持烤制鱿鱼的品质。

表2 不同防腐剂处理烤制鱿鱼37 ℃贮藏条件下感官评分结果（分）Table 2 Sensory evaluation of baked squid during storage using different preservatives at 37 ℃ (scores)

3 结论

通过对三种不同防腐剂处理的烤制鱿鱼片的pH、色泽、菌落总数、挥发性盐基氮含量、扫描电镜和感官评价的测定，可以看出乳酸链球菌素处理组烤制鱿鱼片的效果最好。乳酸链球菌素能有效减缓烤制鱿鱼片TVB-N含量、抑制微生物菌落总数和pH的上升，且经乳酸链球菌素处理的烤制鱿鱼片的微观结构更完整。而ε-聚赖氨酸盐在烤制鱿鱼片的护色方面效果更好。相比之下，在本实验中乳酸链球菌素更有利于作为烤制鱿鱼片的食品防腐剂。本实验有助于鱿鱼焙烤食品的研究与产业化转变，为海洋焙烤食品的开发与加工提供了新思路。

实验未对烤制鱿鱼常温和低温的货架期进行研究，后续将开展进一步的实验，建立烤制鱿鱼产品的货架期模型，并对其货架期进行预测，从而得到烤制鱿鱼在常温和低温下的具体贮藏时间，使其能更好的应用于实际生产。