马 帅，王若凡，陈 霖，孟 艳，卢倩倩，张鲁刚

(西北农林科技大学 园艺学院，陕西杨凌 712100)

大白菜(BrassicarapaL.spp.pekinensis)是十字花科芸苔属重要的蔬菜作物之一，大白菜叶球内叶颜色有白色、黄色和橙色。其中，橙色大白菜吸引了消费者和育种者的兴趣，因为其维生素C、类胡萝卜素及矿质元素含量均高于常见的白色大白菜[1-2]。类胡萝卜素是萜类色素物质，在生物体内通过类异戊二烯途径合成，呈现黄色、橙红色和红色。橙色大白菜正是积累了类胡萝卜素使叶片表现出橙色[3]，这种类胡萝卜素主要是前番茄红素和光异构而形成的番茄红素[4]，而番茄红素异构酶(CRTISO)是番茄红素合成的关键酶基因。有报道发现BrCRTISO功能的缺失会导致大白菜中前番茄红素的积累，并使大白菜内叶呈现橙红色[5]。类似现象在其他园艺作物中也报道，Li 等[6]发现花椰菜中通常含有少量的类胡萝卜素，但橙色花椰菜中由于Or基因的突变积累了较多的β-胡萝卜素。Arango等[7]对橙色胡萝卜和白色胡萝卜的研究发现，CYP97A3基因功能的缺失导致橙色胡萝卜中大量积累α-胡萝卜素。陈奕聪等[8]发现红色品种辣椒中的辣椒红素含量显著高于紫色品种辣椒。有报道证明南瓜中CHYB影响叶黄素和紫黄质的合成，LYCE影响类胡萝卜素含量[9-10]。

类胡萝卜素在植物生长发育中有着多种重要的作用，如光吸收、光保护，作为脱落酸、独脚金内酯等植物激素的合成前体，同时类胡萝卜素在人体营养和健康方面也有着重要的作用，如β-胡萝卜素是维生素A的合成前体，叶黄素、番茄红素等可以增强人体的抗氧化能力，预防一些癌症，叶黄素、玉米黄质可以减缓与年龄相关的视网膜损害等[11-14]。因此培育高胡萝卜素蔬菜及研究类胡萝卜素积累机理有重要的实际意义和理论价值。

尽管在植物中类胡萝卜素的生物合成代谢途径已比较清楚，也已明确有些酶在类胡萝卜素积累中发挥着重要作用，如八氢番茄红素合成酶(PSY)、番茄红素ε-环化酶(LYCE)、番茄红素β-环化酶(LCYB)、β-胡萝卜素羟化酶(CHYB)、类胡萝卜素异构酶(CRTISO)等。但有关不同地域条件下的植物类胡萝卜素积累方面的研究报道很少。Tuan等[15]发现光照条件下生长的大白菜中类胡萝卜素总量明显高于黑暗中生长的，且接受光照的大白菜外叶的类胡萝卜素总量是内叶和中叶的30倍。不同地域除了光照条件，光质、温度等也是重要环境因子，因此地域条件对植物类胡萝卜素合成积累的作用应该是多种因素的综合作用，它对发现类胡萝卜素特异积累地区及其栽培条件有重要参考价值。

本研究以两种橙色大白菜为材料，研究了不同地区种植下橙色白菜叶球的类胡萝卜素积累特点。以期了解两种橙色大白菜类胡萝卜素成分及含量在不同地域的差异、探索遗传背景和环境条件对其影响，从而为进一步研究环境因素调控类胡萝卜素的形成奠定基础、为选择橙色大白菜类胡萝卜素积累最适宜种植的地区提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

橙色大白菜‘14杂1’和‘15杂22’种子由西北农林科技大学园艺学院十字花科课题组提供。2018年分别在陕西延安、阎良、汉中、杨凌，山西太原，河南郑州，湖北武汉，四川成都等地示范生产。待叶球成熟后取样，测定单株质量和叶球质量，随机选择3棵成熟叶球，取叶球从外向内数第7片叶的软叶部分3 g存放于离心管，于真空冷冻干燥仪中进行冻干后，放在-80 ℃贮藏，用于类胡萝卜素的提取及组分分析。

1.2 仪器和试剂

仪器：高速冷冻离心机，高效液相色谱仪(岛津，日本)，真空冷冻干燥仪，旋转蒸发仪等。

试剂：甲醇、乙腈(TEDIA，美国)，甲基叔丁基醚(Aladdin，美国)，乙醇、丙酮、二丁基羟基甲苯等。

1.3 方 法

1.3.1 番茄红素异构酶基因突变体的检测 利用橙色大白菜番茄红素异构酶突变体Brcrtiso基因的3′端插入片段设计的特异引物[16]扩增检测‘14杂1’和‘15杂22’是否为携带Brcrtiso基因突变体，若是突变体则会出现一条53 bp的条带，说明携带该基因，反之则不是携带该基因的突变体。上游引物(F)：5′-CAGAAACATCAGGGTTGAAATC-3′ ，下游引物(R)：5′-TTACTGCCGAAAGCGAAA-3′。

1.3.2 类胡萝卜素的提取 将冻干后的白菜叶片研磨并加入5 mL类胡萝卜素提取液[V(丙酮)∶V(乙醇)=1∶1 ]充分混匀后，提取70 min，取出后12 000 r/min离心10 min，重复操作两次后合并上清液。将上清液置于圆底烧瓶中进行 35 ℃的减压蒸干，并用1 mL乙酸乙酯进行溶解，溶解后经0.22 μm滤器过滤到1.5 mL棕色进样瓶中等待上机检测(冻干过程应该避光)。

1.3.3 类胡萝卜素主要成分的定性和定量分析 采用高效液相色谱法测定类胡萝卜素组分，色谱检测系统为：LC-2010 型高效液相色谱仪(日本岛津)，自动进样器，紫外检测器，C30 柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm)；检测波长为450 nm，柱温为35 ℃，流速为1.0 mL/min，样品进样量为 20 μL；流动相A：V(甲醇)∶V(MTBE)∶V(水)=85∶12∶3，流动相B：V(甲醇)∶V(MTBE)∶V(水)=12∶84∶4，各加体积分数0.01% BHT。洗脱方法参照陈鹏飞等[17]、李佩荣等[18]的方法。洗脱条件为0.01～1.01 min：A-B(99∶1)；1.01～24.01 min：A-B(82∶18)；24.01～ 65.01 min：A-B(42∶58)；65.01～75.01 min：A-B(18∶82)；75.01～ 77.01 min：A-B(18∶82)；77.01～78.01 min：A-B(99∶1)。

1.3.4 橙色大白菜类胡萝卜素合成相关基因的表达分析 根据两个橙色大白菜叶球类中检测的胡萝卜素组分情况，进一步分析Br-PSY、Br-Brcrtiso、Br-LYCB、Br-LYCE、Br-CHYB基因的表达水平。

表1 实时荧光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequence used inreal-time fluorescence quantitative PCR

RT-qPCR反应体系为20 μL，其组分比例如下：10 μL 2× RealStar Green Power mixture(TaKaRa，日本) 10 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，模板cDNA(100 ng/μL)2 μL，双蒸水7 μL。扩增程序如下：95 ℃预变性10 min；PCR扩增反应：95 ℃变性5 s；58 ℃退火1 min；72 ℃延伸30 s，循环数为40；熔解曲线：58 ℃，10 s，循环数为75。所有数据均在鲜质量下测定，每个样品包含3次技术重复和3次生物学重复，计算不同样品的Ct值，采用2-ΔΔCt算法计算基因相对表达量。

2 结果与分析

2.1 两个橙色大白菜品种中番茄红素异构酶基因突变体的检测

图1是用橙色大白菜番茄红素异构酶突变体Brcrtiso基因的特异引物[16]扩增‘14杂1’和‘15杂22’的DNA的结果，可以看出两个品种均扩增出大小为530bp的条带，说明两个橙色大白菜品种都携带Brcrtiso基因，为橙色突变体。

2.2 两个品种在不同产地生育期及叶球质量比较

从表2可以看出，‘14杂1’在武汉地区的叶球质量最大，净质量达到6.25 kg ；在太原地区叶球质量最小，净质量只有1.55 kg，相差4倍。同样，‘15杂22’也是在武汉地区的叶球质量最大，净质量达到5.03 kg ；在太原地区叶球质量最小，净质量只有1.1 kg，相差4.6倍。可见，不同地区提供的生长条件对这两个橙色大白菜叶球的生长有着至关重要的作用。另外，笔者发现在所选择的8个供试地点中，‘14杂1’的叶球质量均高于‘15杂22’，这说明‘14杂1’的生长势强于‘15杂22’。

表2 两个品种在不同地区的生育期及叶球质量Table 2 Growth period and leaf-head mass of two varieties in different areas

2.3 不同产地种植的两个品种中类胡萝卜素的含量差异及分析

不同产地‘14杂1’和‘15杂22’两个品种中均检测出α-胡萝卜素、β-胡萝卜素以及少量的番茄红素。图2为武汉地区的两个品种叶球的高效液相色谱图。

2.3.1 α-胡萝卜素的含量差异及分析 由图3可以看出，‘14杂1’和‘15杂22’这两个品种叶球在不同产地的α-胡萝卜素含量差异明显，但趋势相同，‘14杂1’叶球α-胡萝卜素含量高于‘15杂22’。其中，‘14杂1’在阎良地区的α-胡萝卜素含量最高，达到26.15μg/g；在郑州地区的含量最低，为15.00 μg/g。‘15杂22’在阎良地区的α-胡萝卜素含量也最高，达到24.37 μg/g；在延安地区的含量最低，为10.28 μg/g。各个地区中‘14杂1’的α-胡萝卜素含量均高于‘15杂22’，说明遗传背景对α-胡萝卜素的积累有相对稳定的作用，同时不同地方生产的两个品种叶球的α-胡萝卜素含量差异明显，说明生长条件对α-胡萝卜素的积累有重要作用。

2.3.2 β-胡萝卜素的含量差异及分析 由图4可以看出，不同产地的‘14杂1’和‘15杂22’两个品种叶球的β-胡萝卜素含量差异较小，与α-胡萝卜素相比较，两个品种中β-胡萝卜素的含量都低于α-胡萝卜素含量。其中‘14杂1’在阎良地区的β-胡萝卜素含量最高，达到8.55 μg/g；在武汉地区含量最低，为7.80 μg/g。‘15杂22’在阎良地区的β-胡萝卜素含量最高，达到9.18 μg/g；在延安地区含量最低，为7.39 μg/g。除了阎良，在其他地区也表现出‘14杂1’叶球的β-胡萝卜素含量高于‘15杂22’的现象，但差异较小。总体而言，β-胡萝卜素含量表现为‘14杂1’和‘15杂22’品种间差异不明显，不同地区间差异也不明显，这一方面说明‘14杂1’和‘15杂22’的遗传背景对β-胡萝卜素含量具有相同影响，另一方面说明这几个栽培地方的条件对β-胡萝卜素含量没有显著影响。

2.3.3 番茄红素的含量差异及分析 图5可以看出，不同地区‘14杂1’和‘15杂22’两个品种叶球的番茄红素含量差异很大，而且两个品种在不同地方表现也不一致。在‘14杂1’叶球中，只有在阎良、郑州、武汉、成都4个地区生产的叶球检测出番茄红素，在延安、太原、汉中、杨凌4个地区没有检测出番茄红素。在‘15杂22’叶球中，除了太原地区没有检测到番茄红素，其余地区均有不同含量的番茄红素。其中，‘14杂1’在武汉地区的番茄红素含量最高，达到23.26 μg/g；在阎良地区含量最低，为0.57 μg/g，相差40倍；‘15杂22’在武汉地区的番茄红素含量最高，达到22.78μg/g；在阎良地区含量最低，为3.35 μg/g，相差6.8倍。番茄红素是橙色大白菜的特有色素。总体而言，番茄红素含量表现为‘14杂1’和‘15杂22’品种间差异显著、不同地区间差异显著，特别是品种与地区间互作差异显著，说明影响‘14杂1’和‘15杂22’叶球番茄红素含量的因素，除了遗传背景和栽培地方的条件外，基因型与栽培条件的互作尤为重要。

2.4 不同产地种植的两个橙色大白菜品种叶球中胡萝卜素合成相关基因表达分析

根据‘14杂1’和‘15杂22’两个品种叶球中检测到的类胡萝卜素成分，进一步检测胡萝卜素合成相关基因(PSY、LYCE、LYCB和CRTISO、CHYB)表达情况。

PSY基因是类胡萝卜素代谢的限速酶基因[19]，表达分析表明，同一品种不同地区生产的橙色大白菜叶球的PSY基因的表达水平差异明显，同一地区不同品种PSY基因的表达水平的差异因地区不同而异。以杨陵的‘14杂1’为标准，除了成都的‘14杂1’、杨凌的‘15杂22’中相对表达量下调外，其他地区两个品种PSY基因的表达水平均上调，而且‘15杂22’中的上调幅度大于‘14杂1’，尤其是在延安、阎良、汉中和成都‘15杂22’中的上调幅度更大(图6)，说明‘15杂22’中的类胡萝卜素代谢流较‘14杂1’强。

LYCE催化番茄红素转化为α-胡萝卜素。品种比较而言，不同地方的‘15杂22’中的表达整体低于在‘14杂1’，这与α-胡萝卜素含量的趋势一致。两个品种在不同地方的表达规律不同，‘14杂1’表现为在杨凌、成都、汉中的叶球中表达水平较低，在郑州、延安、太原地区的叶球中表达量较高，可达到杨凌地区的2～6倍；‘15杂22’表现为在太原、郑州、武汉、成都的叶球中表达量最低，在阎良、杨凌地区的叶球中表达中等，在延安、汉中的表达最大。

LYCB催化番茄红素转化为β-胡萝卜素。品种比较来看，两个品种在延安、阎良、郑州、杨凌4个地方的表达差异不显著，在太原、武汉、成都、汉中4个地方的表达差异显著，这与β-胡萝卜素含量的趋势不一致。两个品种在不同地方的表达规律各有特点，在各地区的‘14杂1’中相对表达量差异不大，其中在太原、武汉地区样本中相对表达量较高；在延安、阎良、郑州、杨凌、成都、汉中地区相对表达量低且差异不大。LYCB在各地区的‘15杂22’中的相对表达量差异较大，其中在杨凌的表达水平最低，在成都的表达水平最高。

CRTISO催化前番茄红素转化为前番茄红素。品种比较来看，除了杨凌、太原和武汉，其他5个地方的表达都是‘15杂22’高于‘14杂1’，这与番茄红素的含量趋势基本一致。但是两个品种在不同地方的表现各不相同，‘14杂1’中相对表达量是太原地区的最高，在成都、汉中、杨凌的相对表达量较低，在延安地区样本未检测到表达；‘15杂22’中相对表达量表现为延安地区的最高，达到最低表达水平杨凌地区该样本的10倍。

CHYB催化植物中β-胡萝卜素经中间产物β-黄素合成玉米黄素的过程。品种比较来看，两个品种的表达没有规律。不同品种在不同地方的表达各有特点，在‘14杂1’中相对表达量在武汉、太原地区较高，在郑州、阎良、杨凌、成都、汉中表达量较低，延安没有检测到表达；在‘15杂22’中相对表达量表现为汉中地区的最高，郑州地区表达最低。两品种表达差异显著的地区是延安、成都、汉中、太原，其中延安、成都、汉中都是‘15杂22’的相对表达量高于‘14杂1’，而太原表现 相反。

3 结论与讨论

3.1 不同橙色大白菜品系和品种叶球的类胡萝卜素含量

有关橙色大白菜类胡萝卜素种类及含量的差异分析研究较少。陈鹏飞等[20]在橙色大白菜自交系160、161中检测到了番茄红素、β-胡萝卜素及叶黄质混合物，未检测到α-胡萝卜素。张俊祥等[4]报道在橙色叶球大白菜自交系中主要积累前番茄红素和番茄红素及少量的γ-胡萝卜素，但是没有检测到β-胡萝卜素和叶黄素。李娟[21]测定了橙色大白菜杂交种‘金冠1号’和‘金冠2号’叶球中类胡萝卜素成分和含量，在两个品种中均检测到叶黄素、番茄红素、α-胡萝卜素和β-胡萝卜素，进一步分析表明‘金冠1号’β-胡萝卜素含量比‘金冠2号’低，叶黄素、番茄红素、α-胡萝卜素都较‘金冠2号’高。‘金冠1号’中的叶黄素、番茄红素、α-胡萝卜素及‘金冠2号’中的叶黄素在植株结球过程中整体呈下降趋势。‘金冠2号’的番茄红素含量在结球期先下降后上升，整体含量有所提高。‘金冠1号’中的β-胡萝卜素和‘金冠2号’中的α-胡萝卜素、β-胡萝卜素在结球期先上升后下降。

本研究中，对种植在不同地区的两个橙色大白菜新品种所积累的类胡萝卜素成分及含量进行分析，结果在两个品种中均检测到α-胡萝卜素、β-胡萝卜素和番茄红素，进一步分析发现两个品种中β-胡萝卜素的含量在品种间差异不明显。在所有产地中，两个品种中β-胡萝卜素的含量均低于α-胡萝卜素含量，且在这两种类胡萝卜素含量上，几乎所有的‘14杂1’均高于‘15杂22’。在两个品种中也检测到较少量的番茄红素，其含量与地区相关。在山西太原地区种植的两个品种中未检测出番茄红素，在武汉地区种植的两个品种中番茄红素含量均显著高于其他地区，结合两个地方的叶球生长情况，武汉地区种植的两个品种叶球坚实，单球分别达到6.25 kg和5.03 kg,而太原地区种植的两个品种叶球紧实度低，单球分别为1.55 kg和1.1 kg，可能说明番茄红素在叶球发育后期积累、且与叶球紧实度有关。比较两个供试品种，在其他6个地区中‘15杂22’的番茄红素含量均高于‘14杂1’，这与α-胡萝卜素含量相反，这与两种成分位于同一代谢通路相一致。

与前人研究比较看出，不同橙色大白菜其叶球类胡萝卜素的组分和含量有所差异，其主要原因可能与所选择的供试材料遗传背景不同有关，如有的研究者采用的试验材料是各自的自交系材料[4，17]，有的是杂交种材料。不同自交系间其遗传背景不同，由于亲本遗传背景不同、其杂交种遗传结构必然不同。笔者在育种实践也发现不同橙色大白菜自交系的球叶颜色也有深浅之分，说明不同橙色大白菜虽然带有相同的突变基因Brcrtiso，由于遗传背景不同，其叶球类胡萝卜素的组分和含量有所不同，因此可能还存在其他调控类胡萝卜素代谢的因子，有待进一步研究。

3.2 不同产地的橙色大白菜叶球中类胡萝卜素组分与含量

关于类胡萝卜素成分及含量与环境间的关系，也有不少研究。Adalid等[22]发现在大田栽培的野生樱桃番茄的雄性亲本β-胡萝卜素含量高于保护地栽培，母本则相反，其F1、F2代的在保护地栽培β-胡萝卜素含量高于大田栽培，这些结果表明该品种的β-胡萝卜素积累特性可能受基因型和环境相互作用的影响。Wimalasiri等[23]发现不同气候的不同国家种植的同一品种苦瓜具有不同的类胡萝卜素含量，这可能是由于温度、海拔、降水量3个因素通过影响类胡萝卜素代谢途径进一步影响了类胡萝卜素含量。Salvador等[24]通过相关性分析发现当地樱桃型番茄β-胡萝卜素的积累表现出非常高的基因型和环境相互作用的结果。李娟[21]对不同地区生产的橙色大白菜‘金冠1号’和‘金冠2号’叶球中类胡萝卜素成分和含量进行分析，结果发现甘肃定西生产的‘金冠1号’中未检测出叶黄素和番茄红素，β-胡萝卜素含量也较低，α-胡萝卜素含量较高，但低于同地区生产的‘金冠2号’，也低于陕西生产的‘金冠1号’；而甘肃定西生产的‘金冠2号’中未检出番茄红素，叶黄素含量很低，β-胡萝卜素含量较高，但低于陕西的‘金冠2号’，而α-胡萝卜素含量很高，并高于陕西的‘金冠2号’大白菜。

本研究发现不同地区生产的‘14杂1’和‘15杂22’这两个品种叶球的α-胡萝卜素含量和番茄红素含量与生产地关系密切，一方面表现为同一品种不同生产地的同一类胡萝卜素的含量不同，如不同产区‘14杂1’和‘15杂22’的α-胡萝卜素含量的差异最大达到1.74倍和2.37倍；另一方面表现为同一品种不同类胡萝卜素与生产地区互作不同，如‘15杂22’的3种类胡萝卜素含量在不同地区的变化不一致，表现为β-胡萝卜素含量受栽培环境影响小，α-胡萝卜素含量在陕西阎良含量最高，武汉最低；而番茄红素含量与其相反，说明α-胡萝卜素代谢分支与番茄红素关系密切。在8个供试地点中，阎良这一地区的α-胡萝卜素和β-胡萝卜素含量高于其他地区，可以说明阎良地区所提供的环境条件较其他地区更适于这两类类胡萝卜素的积累，而湖北武汉地区生产的橙色大白菜更适于番茄红素的积累。

前人研究报道往往只分析了一个地方的样品[25]，不能了解环境要素对类胡萝卜素积累的影响，本研究对不同地区两种橙色大白菜类胡萝卜素的分析，发现遗传背景和环境因素都是影响橙色大白菜类胡萝卜素积累的重要因素，这为全面深入研究大白菜类胡萝卜素积累规律指明了方向，也为橙色大白菜专用功能品种的选育提出了新的课题。

3.3 不同产地的两个橙色大白菜叶球中类胡萝卜素积累与相关基因表达的关系

在不同基因型玉米中,LYCE基因的多态性是造成籽粒 β-胡萝卜素含量差异的主要原因[26-27]。在甘薯块根中,LCYB是 β-胡萝卜素合成途径的关键酶基因[28]。在胡萝卜叶片中，LYCE表达量与叶黄素、总类胡萝卜素含量之间呈负相关，说明LYCE对叶中主要类胡萝卜素的积累起着关键性作用[29]。刘英明等[30]发现在两个番茄品种的成熟果实中，PSY基因表达量存在差异，红果中的表达量高于粉果，且PSY基因在番茄不同组织器官中的表达也具有明显差异，这说明PSY基因可能在调控番茄果肉颜色形成中起重要作用。本研究对不同地区生长的两个橙色大白菜新品种叶球类胡萝卜素合成相关基因表达进行了分析发现，不同地方的‘15杂22’中LYCE的表达整体低于在‘14杂1’，这与α-胡萝卜素含量的趋势一致。除了杨凌和太原，6个地方‘15杂22’的CRTISO表达都是高于‘14杂1’，这与番茄红素的含量趋势基本一致。而两个品种的LYCB和CHYB表达没有规律。相关性分析发现，两个品种叶球中各种类胡萝卜素成分含量和总含量与单个基因的表达都没有达到显著相关性，说明单个基因表达不是决定类胡萝卜素含量的主要因素，某种类胡萝卜素的积累是其合成与转化及其整体代谢流共同作用的结果，也可能还存在其他未发现的基因参与类胡萝卜素含量积累。

总体而言，本试验从两个橙色大白菜品种叶球产品类胡萝卜素组分与含量变化分析中发现橙色大白菜类胡萝卜素代谢受遗传背景、栽培条件及其互作作用影响的多样性和复杂性，但具体的环境条件如何从分子水平影响橙色大白菜类胡萝卜素代谢有待于进一步研究。