庄博，张健，孙铁权，李佳鑫，乔建伟，韩禹华，李佳鑫

（1辽宁省葫芦岛市中心医院眼科，葫芦岛 125000；2辽宁省葫芦岛市中心医院龙湾院区眼科，葫芦岛 125000；3葫芦岛市南票矿务局总医院五官科，葫芦岛 125027；4葫芦岛市连山区医院眼科，葫芦岛 125027；5石家庄市第一医院眼科，石家庄 050000）

糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy, DR）是一种常见的I型和II型糖尿病的微血管并发症，在我国糖尿病患者人群中的发病率为23.0%[1]。视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium, RPE）细胞是DR体外研究的常用眼内细胞之一，具有合成黑色素及生成过氧化脂质等多种生理功能[2,3]。既往研究表明，RPE细胞长期处于高糖环境下可产生活性氧，诱发氧化应激以及炎症反应，从而导致RPE细胞损伤发生DR[4]。目前对于RPE细胞损伤常采用抗氧化类以及抗血管生成类药物治疗[5]。阿柏西普（aflibercept，ABC）是一种抗血管生成的融合蛋白，有研究发现其可抑制体外培养的高糖环境下人视网膜Müller细胞K+通道，抑制高糖诱导的Müller细胞凋亡，促进细胞增殖[6]。然而ABC在DR中的作用机制尚不清楚。另外，已有研究证实PI3K/AKT信号通路的激活与视网膜色素上皮细胞损伤有关[7]，PI3K/AKT信号通路的激活可促进视网膜新生血管的形成[8]。本研究使用高糖刺激RPE细胞模拟DR模型，旨在探讨ABC通过PI3K/AKT信号通路对高糖诱导的RPE细胞损伤的影响。

材料与方法

1 材料与仪器

人视网膜色素上皮细胞APRE-19购自美国ATCC公司；阿柏西普（规格：0.1ml/4mg，批号：191211，批准文号：注册证号S20180001）购自德国Vetter Pharma-Fertigung GmbH&Co.KG公 司；一抗PI3K磷酸化蛋白（p-PI3K）抗体（1:1000，ab195854）、一抗AKT磷酸化蛋白（p-AKT）抗体（1:1000，ab8933）、GAPDH（1:2000，ab8245）和HRP偶联的山羊抗兔IgG（1:2000，ab6721）均购自上海Abcam公司；ECL试剂盒购自上海Beyotime公司；TBST缓冲液购自上海博湖生物科技有限公司；RIPA裂解液、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）ELISA检测试剂盒均购自上海江莱生物科技有限公司；白介素-1β（IL-1β）和白介素-6（IL-6）ELISA试剂盒购自南京建成生物研究所；SDS-PAGE凝胶电泳液购自北京百奥莱博科技有限公司；BCA蛋白定量试剂盒购自上海炎熙生物科技有限公司；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒购自英国Abcam公司；超氧化物歧化酶（SOD）活性测定试剂盒购自上海Abcam公司；3K30低温高速离心机，购自美国Sigma公司；Bio-Rad电泳仪，购自南京贝登医疗股份有限公司；Bio-Rad转膜仪，购自上海艾研生物科技有限公司；BD-YG3002荧光显微镜，购自深圳市博视达光学仪器有限公司。

2 细胞培养及处理

将APRE-19细胞随机分为对照组、高糖组（HG组）、HG+ABC组。对照组细胞置于添加了10%胎牛血清，100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM培养基中常规培养，不做任何干预；HG组细胞用30mmol/L葡萄糖培养液培养；HG+ABC组细胞用30mmol/L葡萄糖和2mg/ml ABC的培养液培养。培养环境为37℃，5%CO2，收集各组细胞用于后续实验。

3 TUNEL法检测APRE-19细胞凋亡

取各组对数生长期细胞，用PBS洗涤细胞，5%多聚甲醛固定5min，再用PBS冲洗，用蛋白酶K 20μg/ml消化30min，PBS冲洗细胞3次，每次5min，再用3% H2O2和0.1% Triton X-100培养10min，之后使用TUNEL细胞凋亡检测试剂盒染色， 37℃避光孵育1h。孵育结束后，用PBS洗涤3次，最后用DAPI标记1min，在荧光显微镜下观察，并采集图像。根据TUNEL阳性细胞数与DAPI阳性细胞数的比值计算细胞凋亡率。

4 ELISA法检测 IL-1β和IL-6含量

取各组对数生长期细胞，接种于96孔板上，密度为1×104，在37℃下孵育12h，孵育后收集培养液，采用ELISA法检测细胞中IL-1β、IL-6含量。

5 GPx、SOD活性检测

取各组对数生长期细胞，离心后取上清液采用试剂盒测定细胞中GPx、SOD活性，GPx活性用ELISA法检测，SOD活性用比色法检测。

6 Western blot分析

取各组对数生长期细胞，使用RIPA裂解缓冲液匀浆裂解，高速离心后收集蛋白上清，用BCA蛋白定量试剂盒对蛋白进行定量，再将蛋白置于水浴锅中100℃下加热10min变性。每孔取30µg蛋白上样，进行SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白质，随后电转至PVDF膜上。用含5%脱脂乳脂的TBST封闭2h，加入一抗于4℃条件下孵育过夜。TBST溶液漂洗PVDF膜后，再加入HRP偶联二抗室温孵育1h。TBST溶液再次漂洗后使用ECL化学发光显影，采用Image J图像分析系统分析各组蛋白条带光密度值，以GAPDH作为内参，检测各组p-PI3K以及p-AKT的表达水平。

7 统计分析

本研究所有数据统计分析均采用Graphpad Prism 7.0软件完成，实验数据以均值±标准差表示，两组间的比较进行t检验，多组间比较采用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。所有实验重复3次。

结 果

1 阿柏西普抑制高糖诱导的APRE-19细胞凋亡

TUNEL法检测细胞凋亡率显示，HG组与对照组比较，凋亡率显著增加；HG+ABC组与HG组比较，凋亡率显著降低（图1）。此结果说明高糖刺激APRE-19细胞可促进细胞凋亡，而ABC可抑制高糖刺激诱导的APRE-19细胞凋亡。

图1 TUNEL法检测APRE-19细胞凋亡率。A，代表性TUNEL染色结果。比例尺，250μm；B，细胞凋亡率统计学分析；与对照组比较，***P<0.001；与高糖组比较，**0.001

2 阿柏西普抑制高糖诱导的APRE-19细胞中IL-1β和IL-6水平升高

ELISA法检测细胞内IL-1β、IL-6水平显示：与对照组相比，HG组细胞IL-1β和IL-6含量显著升高；与HG组比较，HG+ABC组细胞IL-1β和IL-6含量显著降低（图2）。由此说明高糖刺激可诱导APRE-19细胞炎症反应，而ABC可抑制高糖刺激诱导的炎症反应。

图2 ELISA法检测高糖刺激和ABC对APRE-19细胞炎症反应的影响。A，IL-1β水平；B，IL-6水平；与对照组比较，***P<0.001；与高糖组比较，**0.001

3 阿柏西普抑制高糖诱导的APRE-19细胞中GPx和SOD活性下降

分别用ELISA法和比色法检测APRE-19细胞内抗氧化物质GPx和SOD活性显示：与对照组相比，HG组细胞内GPx和SOD活性显著降低；与HG组相比，HG+ABC组细胞内GPx和SOD活性显著上升，但仍低于对照组（图3）。此结果说明高糖刺激可诱导APRE-19细胞氧化应激，而ABC可通过抑制高糖刺激诱导的GPx和SOD活性降低而改善氧化应激。

图3 ELISA法和比色法检测高糖和ABC对APRE-19细胞氧化应激的影响。A，GPx水平；B，SOD水平；与对照组比较，***P<0.001；与高糖组比较，**0.001

4 阿柏西普抑制高糖诱导的APRE-19细胞中p-PI3K和p-AKT水平上调

Western blot检测显示：HG组细胞中p-PI3K和p-AKT水平较对照组显著升高；HG+ABC组p-PI3K和p-AKT水平较HG组显著降低（图4）。由此说明高糖刺激可显著激活PI3K/AKT信号通路，而ABC处理后可抑制高糖对PI3K/AKT信号通路的激活。

图4 Western blot检测高糖和ABC对I3K/AKT信号通路的影响。A，p-PI3K水平代表性Western blot检测（上）和统计学分析（下）；B，p-AKT水平代表性Western blot检测（上）和统计学分析（下）；与对照组比较，***P<0.001；与高糖组比较，**0.001

讨 论

RPE细胞参与多种眼底疾病的发生发展，在正常情况下含有大量GPx、SOD等抗氧化物质，而在DR的发病过程中易受损凋亡，导致抗氧化物质含量以及活性下降，引起氧化损伤[9,10]。另外， RPE细胞损伤的病理机制与高血糖密切相关，在高血糖状态下，过量的自由基和活性氧会降低谷胱甘肽的水平，导致氧化应激，最终发展为病理状态[11]。且有研究进一步说明，高浓度葡萄糖会诱导视网膜炎症，增加RPE细胞中炎性因子的水平，如有研究指出使用高糖处理RPE细胞，细胞内IL-1β和IL-18的分泌水平以及NLRP3炎症小体的表达水平也相应上升[12,13]。ABC是一种人源化重组融合蛋白，其通过与血管内皮生长因子-A、B及胎盘生长因子特异性结合抑制血管生成，在视网膜静脉阻塞及早产儿视网膜病变等眼科疾病中发挥重要作用[14]。但ABC在RPE细胞损伤方面的抗炎以及抗氧化作用的研究报道较少，且其分子机制尚未明确。

本研究使用浓度为30mmol/L的葡萄糖诱导RPE细胞损伤，结果显示高糖组的细胞凋亡率显著增加，细胞中IL-1β、IL-6水平显著上升，GPx、SOD活性显著降低；随后给予2mg/ml ABC处理细胞，并观察ABC对RPE细胞的保护作用，发现高糖诱导的细胞凋亡率升高、细胞内IL-1β和IL-6水平升高显著降低，GPx和SOD活性的降低明显减弱，说明ABC可显著减轻高糖诱导的RPE细胞凋亡、炎症反应及氧化应激。

PI3K/AKT信号通路与RPE细胞损伤存在着重要联系，如：激活PI3K/AKT信号通路可促进多种促炎因子的表达，使用高糖处理RPE细胞后会激活PI3K/AKT信号通路，促进PI3K和AKT的磷酸化，从而导致炎性因子过量分泌[15,16]。在本研究中，高糖组细胞中p-PI3K以及p-AKT水平显著升高，经ABC处理细胞后，p-PI3K以及p-AKT水平显著降低，这说明PI3K/AKT信号通路介导了RPE细胞损伤，而ABC可抑制PI3K和AKT的磷酸化，抑制高糖诱导的PI3K/AKT信号通路激活。综上，本研究首次发现ABC可通过抑制PI3K/AKT信号通路抑制细胞凋亡、减轻氧化应激和炎症反应，从而改善高糖诱导的RPE细胞损伤，为预防和治疗DR提供了一定的理论依据。