王蓉，王静，赖晨欢，黄曹兴，凌喆，勇强*

(1. 南京林业大学，江苏省林业资源高效加工利用协同创新中心，南京 210037；2. 广东省林业科学研究院，广东省森林培育与保护利用重点实验室，广州 510520)

葡甘露低聚糖(Glucomannan oligosaccharides，GMOS)是由2～20个葡萄糖或甘露糖通过糖苷键连接而成的低聚合度糖类的总称，具有防癌抗癌[1]、免疫调节和细胞修复等生物学功能[2]，是一种重要的功能性低聚糖。葡甘露低聚糖可通过选择性降解葡甘露聚糖制得，目前已报道的葡甘露低聚糖制备方法主要有物理降解、氧化降解、酸水解和酶水解等[3-4]，其中酶水解法具有专一性强、反应条件温和及绿色环保等优点，工业应用前景广阔。

β-甘露聚糖酶(EC 3.2.1.78)是一类可以水解β-D-1,4-甘露糖苷键的内切型水解酶，其能够随机水解葡甘露聚糖主链中的β-D-1,4-糖苷键生成葡甘露低聚糖。里氏木霉(Trichodermareesei)是常用的β-甘露聚糖酶生产菌株之一，其所产的酶具有稳定性好且对人和动物安全的特点，被广泛应用于食品和饲料工业生产中。里氏木霉源甘露聚糖水解酶系中除了β-甘露聚糖酶，还含有β-甘露糖苷酶(EC 3.2.1.25)和β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)等糖苷水解酶。其中，β-甘露糖苷酶可作用于葡甘露低聚糖的末端，催化β-1,4-糖苷键水解释放出甘露糖[5]。因此，研究甘露聚糖酶酶系组成对葡甘露低聚糖的酶法制备具有重要意义。

笔者以里氏木霉为产酶菌株，研究碳源诱导物对甘露聚糖酶酶系组成的影响以及魔芋葡甘露聚糖酶法制备葡甘露低聚糖工艺，并在体外模拟人体肠道严格厌氧环境，研究葡甘露低聚糖对肠道微生物的增殖作用，研究结果可为葡甘露聚糖选择性降解制备葡甘露低聚糖技术的建立以及葡甘露低聚糖的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

里氏木霉(T.reesei)Rut C-30，由南京林业大学生物化工研究所提供；肠道微生物典型菌株双歧杆菌乳酸亚种BifidobateriumanimalissubspecieslactisB-41405，动物双歧杆菌亚种B.animalissubspeciesanimalisB-41406，双歧杆菌B.suisB-41407，短双歧杆菌B.breveB-41408，两歧双歧杆菌B.bifidumB-41410，婴儿双歧杆菌B.infantisB-41661，嗜酸乳杆菌LactobacillusacidophilusB-4495，清酒乳酸菌L.sakeiB-1917，罗伊式乳杆菌L.reuteriB-14172，鼠李糖乳杆菌L.rhamnosusB-1937，丙酮丁醇梭菌ClostridiumacetobutylicumB-527，丙酮丁醇梭菌C.acetobutylicumB-528，丙酮丁醇梭菌C.acetobutylicumB-530，平肠球菌EnterococcushiraeB-1295，空肠弯曲菌CampylobacterjejuniS107，长双歧杆菌B.longumATCC15697和大肠杆菌EscherichiacoliK12购自美国农业部菌种保藏中心(NRRL)和美国菌种保藏中心(ATCC)。

魔芋精粉，市售，购自云南省昆明市，魔芋精粉经乙醇沉淀法得到高纯度葡甘露聚糖[6]，主要组成(质量分数，下同)：葡甘露聚糖81.3%，淀粉11.8%；微晶纤维素(92%)、洋槐豆胶(半乳甘露聚糖56%)、瓜尔豆胶(半乳甘露聚糖72%)、葡萄糖、甘露糖和木糖(分析纯)均购自美国Sigma-Aldrich公司；其他试剂无特殊注明外，均为分析纯。

1.2 培养基

β-甘露聚糖酶发酵培养基：碳源诱导物10.000 0 g/L、葡萄糖1.000 0 g/L、磷酸二氢钾2.000 0 g/L、七水硫酸镁0.300 0 g/L、无水氯化钙0.300 0 g/L、七水硫酸亚铁0.005 0 g/L、七水硫酸锰0.001 6 g/L、七水硫酸锌0.001 4 g/L、氯化钴0.002 0 g/L、硫酸铵4.720 0 g/L、尿素2.150 0 g/L，用1 mol/L柠檬酸缓冲溶液调节pH至4.8。

肠道微生物活化培养基：酪蛋白胨10.00 g/L、牛肉膏10.00 g/L、酵母提取物5.00 g/L、吐温80 1.00 g/L、乙酸钠5.00 g/L、柠檬酸二铵2.00 g/L、磷酸氢二钾2.00 g/L、一水硫酸镁0.20 g/L、一水硫酸锰0.05 g/L、葡萄糖10.00 g/L、L-半胱氨酸1.00 g/L，用质量分数4%NaOH调节pH至7.0。

肠道微生物增殖培养基：用3.00 g/L葡甘露低聚糖代替活化培养基中10.00 g/L的葡萄糖，其他成分不变。

1.3 试验方法

1.3.1β-甘露聚糖酶发酵

在装有50 mLβ-甘露聚糖酶发酵培养基中分别加入1 g绝干诱导物(微晶纤维素、洋槐豆胶、瓜尔豆胶、魔芋粉以及6种等质量的复配诱导物)，置于170 r/min摇床中培养4 d，产酶第1天温度30 ℃，第2天后温度为28 ℃。

1.3.2 肠道微生物体外培养

肠道微生物活化：活化培养基于121 ℃下灭菌15 min后，转移到DUAL GAS YQX-1型厌氧培养箱(英国Ruskin Life Sciences公司)中，调节pH至7.0，接入17种肠道微生物冻干粉，于37 ℃下活化36 h。

肠道微生物培养：增殖培养基于121 ℃下灭菌15 min后，转移到厌氧培养箱中，调节pH 7.0，吸取4.5 mL培养基于5.0 mL具塞螺纹试管中，接入0.5 mL肠道菌群活化液，于37 ℃下培养48 h。试验按双平行设计，数据用平均值和平均数标准误差(standard error of the mean，SEM)表示。

1.3.3 葡甘露聚糖酶解

称取适量葡甘露聚糖于100 mL酶解瓶中，加入蒸馏水、甘露聚糖酶液，并用质量分数8%H2SO4调节pH至4.8，定容至50 mL后置于50 ℃、150 r/min摇床中酶解。分别研究酶用量(5，10，15，20，25，30和35 U/g葡甘露聚糖)、底物质量浓度(5，10，15，20和25 g/L)和酶解时间(4，8，12，24，36和48 h)对葡甘露低聚糖得率的影响。

1.4 分析方法

1.4.1β-甘露聚糖酶活力测定

在试管中加入0.1 mL适当稀释的酶液和0.9 mL用pH 5.0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液配制的质量浓度为5.0 g/L的洋槐豆胶溶液，于50 ℃、80 r/min恒温水浴中反应30 min，3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定水解产生的还原糖[7]。以每分钟水解底物产生1 μmol还原糖(以甘露糖计)的酶用量定义为1个β-甘露聚糖酶活力单位(U)。

1.4.2β-甘露糖苷酶活力测定

在试管中加入0.1 mL适当稀释的酶液和0.9 mL对硝基苯基-β-D-吡喃甘露糖苷(2 mmol/L)溶液，于50 ℃下保温10 min后，立即加入2.0 mL的Na2CO3(1 mol/L)终止反应，于400 nm下测定吸光度[8]。以每分钟水解对硝基苯基-β-D-吡喃甘露糖苷释放1 μmol对硝基苯酚所需的酶量定义为1个β-甘露糖苷酶活力单位(U)。

1.4.3 滤纸酶活力测定

采用国际理论和应用化学协会(IUPAC)推荐的标准方法测定[9]。在标准反应条件下每分钟水解生成1 μmol葡萄糖的酶用量定义为1个滤纸酶活力单位(FPU)。

1.4.4 木聚糖酶酶活力测定

在试管中加入0.5 mL适当稀释的酶液和1 mL用0.05 mol/L柠檬酸缓冲液配制的质量分数1%的桦木木聚糖溶液，于50 ℃、80 r/min恒温水浴中反应30 min，DNS法测定水解产生的木糖。以每分钟水解生成1 μmol木糖所需的酶用量定义为1个木聚糖酶活力单位(U)。

1.4.5 葡萄糖和甘露糖定量分析

葡萄糖和甘露糖采用DINOX ICS-5000型高效液相阴离子交换色谱分析，外标法测定。色谱条件：Carbo Pac PA10色谱柱(孔径×长=4 mm×250 mm)，进样量10 μL，流动相3 mmol/L NaOH，流速0.2 mL/min，柱温30 ℃，脉冲安培检测器检测。

1.4.6 葡甘露低聚糖的定量分析

在葡甘露聚糖酶解液中加入异丙醇至体积分数为90%，充分混匀后于8 000 r/min下离心5 min，葡甘露低聚糖溶解在上清中，蒸发除去上清中的异丙醇，冷冻干燥后收集固形物。固形物加水定容到一定体积V0，等体积加入质量分数8%的H2SO4，于121 ℃下反应1 h，采用高效阴离子交换色谱测定酸解前后葡萄糖和甘露糖的含量。葡甘露低聚糖得率和酶的选择性计算如下式：

葡甘露低聚糖得率%=[(CA1+CA2-C1-C2) ×2V0×0.9/(m×0.813)]×100

(1)

酶的选择性%=[(CA1+CA2-C1-C2)/(CA1+CA2)]×100

(2)

式中：CA1为酸解液中甘露糖质量浓度，g/L；CA2为酸解液中葡萄糖质量浓度，g/L；C1为酸解前甘露糖质量浓度，g/L；C2为酸解前葡萄糖质量浓度，g/L；0.9为聚糖和单糖的转化系数；m为称取的葡甘露聚糖的质量；0.813为称取的原料中葡甘露聚糖的含量。

1.4.7 肠道微生物浓度测定

取1 mL肠道微生物培养液于10 000 r/min下离心5 min，得到菌体沉淀，用生理盐水洗涤、离心3次，最后加入1 mL生理盐水重悬，采用蒸馏水为空白对照，于600 nm波长下测定菌体的吸光度，根据菌体浓度与吸光度的标准曲线计算培养液中的菌体浓度。

1.4.8 短链脂肪酸定量分析

取培养液离心得到的上清，经0.22 μm滤膜过滤，采用高效液相色谱测定短链脂肪酸(乙酸、丙酸、丁酸和乳酸)含量，色谱条件：Bio-Rad Aminex HPX-87H色谱柱(长×孔径=300 mm×7.8 mm)，进样量10 μL，流动相5 mmol/L H2SO4，流速0.6 mL/min，柱温55 ℃，示差折光检测器检测。

2 结果与分析

2.1 诱导物对里氏木霉发酵甘露聚糖酶酶系组成的影响

里氏木霉β-甘露聚糖酶属于诱导型酶类，其最佳诱导物通常是作用底物或底物的结构类似物[10]。选取10种不同产酶诱导物，不同诱导物对里氏木霉合成甘露聚糖酶酶系组成的影响见表1，当添加富含甘露聚糖的洋槐豆胶、瓜尔豆胶和魔芋粉为产酶诱导物时，β-甘露聚糖酶酶活力分别为1.443,1.195和1.702 U/mL，而采用微晶纤维素作为里氏木霉的产酶诱导物时，β-甘露聚糖酶酶活力达到最高(3.902 U/mL)。王静等[11]同样发现，里氏木霉合成β-甘露聚糖酶的最佳碳源诱导物是与底物结构类似的微晶纤维素。

表1 不同产酶诱导物对甘露聚糖酶酶系组成的影响Table 1 Effects of different enzyme inducers on the composition of mannanase enzymes

发酵液中溶解氧水平是影响里氏木霉发酵产β-甘露聚糖酶的重要因素[12]，β-甘露聚糖溶于水后黏度增加，影响了里氏木霉好氧发酵产酶过程中的氧传质，从而导致洋槐豆胶等诱导产酶作用较差。当微晶纤维素与其他甘露聚糖诱导物按质量比1∶1复配作为诱导物时，β-甘露聚糖酶酶活力为3.514～3.727 U/mL，均显著高于单一甘露聚糖和复配碳源诱导产生的β-甘露聚糖酶酶活力(1.283～1.795 U/mL)，进一步验证了微晶纤维素是里氏木霉合成β-甘露聚糖酶的最佳诱导物。其原因可能是编码β-甘露聚糖酶、纤维素酶和木聚糖酶的基因在相同的启动子操纵下表达，而里氏木霉合成β-甘露聚糖酶与其他糖苷水解酶时存在协同效应所致。

为验证里氏木霉产β-甘露聚糖酶与纤维素酶和木聚糖酶的相关性，以微晶纤维素为碳源诱导物诱导6株里氏木霉菌株，分析其产酶粗酶液中β-甘露聚糖酶、纤维素酶和木聚糖酶酶活力，结果如图1所示。由图1a可知，当以微晶纤维素为诱导物时，6株里氏木霉菌株产酶的粗酶液中β-甘露聚糖酶活力与纤维素酶活力存在正相关性(决定系数R2=0.85)，说明微晶纤维素可同时诱导里氏木霉合成纤维素酶和β-甘露聚糖酶。由图1b可知，粗酶液中β-甘露聚糖酶活力与木聚糖酶活力同样存在正相关性(R2=0.72)，进一步验证了微晶纤维素可同时诱导里氏木霉合成纤维素酶、β-甘露聚糖酶和木聚糖酶。原因可能是在里氏木霉基因组中，编码半纤维素酶(β-甘露聚糖酶和木聚糖酶)和纤维素酶的基因是非随机分布在基因组内，70%的半纤维素酶和纤维素酶的基因位于编码糖苷水解酶(GH)的簇中[13]。

图1 β-甘露聚糖酶与滤纸酶和木聚糖酶酶活力的相关性Fig. 1 Correlations between β-mannanase and filter paper enzyme and xylanase activities

β-甘露聚糖酶酶活与β-甘露糖苷酶酶活之比是评价甘露聚糖水解酶系组成是否适合于葡甘露低聚糖制备的重要指标之一，β-甘露聚糖酶与β-甘露糖苷酶活力比值越高，越适合于葡甘露低聚糖的酶法制备。由表1可知，以洋槐豆胶为单一和复配碳源诱导产甘露聚糖酶时，β-甘露聚糖酶活力与β-甘露糖苷酶活力之比较低，因此不适合应用于葡甘露低聚糖的制备；以瓜尔豆胶和魔芋粉为诱导物时，β-甘露聚糖酶活力与β-甘露糖苷酶活力之比分别为239.0和243.1，均高于微晶纤维素(205.4)，但微晶纤维素诱导产生的β-甘露聚糖酶活力远高于瓜尔豆胶和魔芋粉诱导产生的β-甘露聚糖酶活力。综合考虑选用微晶纤维素诱导里氏木霉合成的甘露聚糖酶进行后续的葡甘露低聚糖的制备。

2.2 酶法制备葡甘露低聚糖的影响因素

酶用量对葡甘露低聚糖得率的影响如图2a所示。当酶用量从5 U/g葡甘露聚糖增加到10 U/g时，葡甘露低聚糖的得率从68.60%提高至76.80%，进一步提高酶用量至35 U/g时，葡甘露低聚糖得率下降至52.30%。酶解液中单糖含量随着酶用量的增加而提高，当酶用量从5 U/g葡甘露聚糖增加到35 U/g时，酶解液中单糖含量从0.64 g/L提高到2.10 g/L；而酶对葡甘露低聚糖的选择性则随着酶用量的增加而降低(从84.90%下降至56.90%)。葡甘露低聚糖得率随着酶用量的增加而降低的原因可能包括两方面：一是随着酶用量的增加，酶解体系中β-甘露糖苷酶和β-葡萄糖苷酶含量增加，促进了葡甘露低聚糖进一步水解成单糖(葡萄糖和甘露糖)；二是水解产物葡甘露低聚糖和单糖的积累可能对β-甘露聚糖酶存在反馈抑制作用[14]。因此，β-甘露聚糖酶酶法制备葡甘露低聚糖的适宜酶用量为10 U/g葡甘露聚糖。

图2 工艺参数对葡甘露低聚糖制备的影响Fig. 2 Effects of process parameters on the GMOS preparation

底物质量浓度对葡甘露低聚糖得率的影响如图2b所示。当底物质量浓度从5 g/L提高至15 g/L时，葡甘露低聚糖的得率从54.01%提高至74.10%；继续增加底物质量浓度至25 g/L时，葡甘露低聚糖的得率下降至62.30%，原因可能是随着底物质量浓度的提高，酶解体系的黏度增加，影响酶解体系中的传质效率[15]。酶对葡甘露低聚糖的选择性随着底物质量浓度的提高而增加，当底物质量浓度从5 g/L提高至25 g/L时，酶对葡甘露低聚糖的选择性从66.60%提高至83.40%。因此，β-甘露聚糖酶酶法制备葡甘露低聚糖的适宜底物质量浓度为15 g/L。

酶解时间对葡甘露低聚糖得率的影响如图2c所示。在酶解初期，葡甘露低聚糖得率随着反应时间的延长迅速提高，酶解8 h时，葡甘露低聚糖得率为73.70%；继续延长酶反应时间，葡甘露低聚糖得率呈缓慢上升的趋势；24 h后，葡甘露低聚糖得率呈下降趋势。酶解体系中单糖含量与酶对葡甘露低聚糖的选择性变化趋势相反，随着酶解反应时间延长，酶解液中单糖含量增加，而酶对葡甘露低聚糖的选择性降低。因此，葡甘露聚糖酶法制备葡甘露低聚糖的适宜反应时间为8 h，在此条件下，葡甘露低聚糖得率和酶对葡甘露低聚糖的选择性分别为73.70%和85.60%，显著高于许少春等[16]利用黑曲霉酸性β-甘露聚糖酶酶解魔芋粉制备葡甘露低聚糖的得率(35.73%)，以及娄广庆[17]对降解产物进行超滤得到葡甘露低聚糖得率(6.63%)。由此可知，酶法更适用于葡甘露低聚糖的制备，与黑曲霉相比，里氏木霉发酵生产的β-甘露聚糖酶更适用于葡甘露低聚糖的生产，其原因可能是β-甘露糖苷酶酶活更低，导致单糖产生更少。

2.3 葡甘露低聚糖作为碳源对肠道微生物的体外培养

2.3.1 葡甘露低聚糖对肠道微生物的增殖作用

3 g/L葡甘露低聚糖对典型肠道微生物(14种有益菌和3种潜在致病菌)体外严格厌氧培养，葡甘露低聚糖对肠道微生物的增殖作用如图3所示。由图3可知，葡甘露低聚糖对典型肠道微生物中14种有益菌均有增殖作用，而3种潜在致病菌平肠球菌(E.hiraeB-1295)、空肠弯曲菌(C.jejuniS107)和大肠杆菌(E.coliK12)几乎不能利用葡甘露低聚糖进行增殖。其中，有益菌中长双歧杆菌(B.longumATCC15697)和嗜酸乳杆菌(L.acidophilusB-4495)增殖效果最好，菌体质量浓度从初始的0.02 g/L分别提高到0.54 和0.39 g/L，分别增殖27.0和19.5倍；初始质量浓度为0.02 g/L的平肠球菌、空肠弯曲菌和大肠杆菌3种潜在致病菌以3 g/L 葡甘露低聚糖为碳源培养48 h，菌体质量浓度分别为0.07，0.03和0.02 g/L。

图3 葡甘露低聚糖对肠道微生物的增殖作用Fig. 3 Effects of glucomannan oligosaccharides on the proliferation of intestinal microorganisms

2.3.2 肠道微生物代谢葡甘露低聚糖的短链脂肪酸产物分析

功能性低聚糖在人或动物体肠道中的作用除了促进肠道有益菌增殖，肠道微生物代谢功能性低聚糖产生的短链脂肪酸还具有降低肠道pH、抑制肠道腐败细菌生长、防止便秘等功能，同时丁酸还具有营养肠道上皮细胞的作用。典型肠道微生物以3 g/L葡甘露低聚糖为碳源培养，不同肠道微生物代谢葡甘露低聚糖产生的短链脂肪酸情况如图4所示。

图4 肠道微生物发酵葡甘露低聚糖生成的短链脂肪酸分析Fig. 4 Short chain fatty acids production fermented by intestinal microorganisms with GMOS as a carbon source

与葡甘露低聚糖对肠道典型微生物增殖作用趋势一致，长双歧杆菌(B.longumATCC15697)和嗜酸乳杆菌(L.acidophilusB-4495)发酵葡甘露低聚糖产生的短链脂肪酸含量最高，分别为(78.5±3.5)和(42.6±2.6) mmol/L。其中，乳酸和丁酸是B.longumATCC15697和L.acidophilusB-4495发酵生成的主要短链脂肪酸，分别为(38.9±1.2),(32.1±7.1) mmol/L和(25.0±3.0),(14.0±4.0) mmol/L；而乙酸和丙酸含量低，仅为(4.5±0.4),(1.6±0.3) mmol/L和(0.3±0.1),(0.8±0.2) mmol/L；其他有益菌产生的短链脂肪酸的浓度相对较低，在3.0～32.0 mmol/L之间；而潜在致病菌中除空肠弯曲菌(C.jejuniS107)发酵产生9.9 mmol/L短链脂肪酸外，平肠球菌(E.hiraeB-1295)和大肠杆菌(E.coliK12)产生的短链脂肪酸极少(0.6和0.9 mmol/L)。

3 结 论

1)里氏木霉以10 g/L的微晶纤维素为诱导物合成甘露聚糖酶，β-甘露聚糖酶和β-甘露糖苷酶酶活力分别为3.902和0.019 U/mL，酶活比为205.4∶1.0，可作为葡甘露聚糖酶法制备葡甘露低聚糖的专用酶制剂。里氏木霉以微晶纤维素为诱导物发酵，可同时诱导合成β-甘露聚糖酶、纤维素酶和木聚糖酶，β-甘露聚糖酶活力与纤维素酶、木聚糖酶酶活力均呈正相关性。

2)葡甘露聚糖在底物质量浓度15 g/L、酶用量10 U/g、50 ℃和pH 4.8条件下经β-甘露聚糖酶酶解8 h，葡甘露低聚糖得率为73.70%，酶对葡甘露低聚糖的选择性为85.60%。

3)3 g/L葡甘露低聚糖对肠道微生物有选择性增殖作用，对双歧杆菌和乳杆菌的增殖作用显著，对潜在致病菌平肠球菌(E.hiraeB-1295)、空肠弯曲菌(C.jejuniS107)和大肠杆菌(E.coliK12)几乎无增殖作用，对长双歧杆菌(B.longumATCC15697)和嗜酸乳杆菌(L.acidophilusB-4495)的增殖效果最好，分别增殖27.0和19.5倍；且发酵葡甘露低聚糖产生的短链脂肪酸最高，分别为(78.5±3.5)和(42.6±2.6) mmol/L，其中，乳酸和丁酸是主要的短链脂肪酸。