姚周麟 吴韶辉 林 媚平新亮

（浙江省柑橘研究所 台州 318026）

柚皮素（Naringenin，NAR）是一种天然的类黄酮物质，属于二氢黄酮类，是柚皮苷（Naringin）的苷元，主要存在于芸香科植物如葡萄柚、橙、佛手柑等柑橘类水果中。柚皮素在常温下为白色针状结晶，溶于乙醇、乙醚和苯等有机溶剂，几乎不溶于水。柑橘中的柚皮素主要存在果皮中，如温州蜜柑和红美人的果皮中的柚皮素含量达 4.82、11.36 mg/kg[1]，果肉仅分别为0.09、0.20 mg/kg；李勋兰等[2]研究了11种柑橘果肉的柚皮素含量也发现仅有 0.01～0.28 mg/kg。

柚皮素具有抗菌、抗炎、清除自由基、抗氧化、止咳祛痰、降血脂、抗肿瘤、解痉和利胆、预防和治疗肝病、抑制血小板凝结、抗粥样动脉硬化等多种药理活性（图1）。如柚皮素能减轻抗结核药引起的大鼠肝肾损伤[3]；促进糖尿病大鼠中二甲双胍的清除[4]；可作为 T细胞介导的自身免疫性炎症疾病的预防/治疗剂[5]和免疫相关疾病治疗剂中潜在的免疫调节剂[6]；可减少I型糖尿病大鼠晶状体的氧化应激标志物[7]，用于多种氧化应激疾病[8]；能有效抑制前列腺癌的转移[9]；柚皮素纳米制剂在预防和治疗癌症中有潜力[10]，和橙皮素联合治疗一种胰腺癌而不会引起对正常细胞的毒性[11]等，可被广泛地应用于医药、食品等领域。本文综述了柑橘柚皮素的提取与手性对映体拆分方法等方面的研究，并对手性柚皮素的研究方向进行了展望，为柑橘中手性类黄酮物质的开发利用提供理论参考。

图1 柚皮素抗氧化作用原理

1 柚皮素的提取方法

柚皮素的提取对分析结果至关重要，某种程度上来说，前处理决定了分析测试的结果，直接影响分析数据的精确性。柑橘中柚皮素等类黄酮成分检测的前处理提取方法常用的为溶剂萃取法[12]，利用该组分在两种互不相溶的试剂中分配系数的不同，使其从一种溶液转移至另一种溶剂，从而达到分离和富集的目的，但萃取溶剂通常易挥发、易燃、用量大，且有毒性；其他方法还有酶解法、超声波提取法等。

1.1 单一提取法

国内外研究人员对植物中类黄酮等有效成分的提取方法做了较多的研究。Wu[13]等用深共熔溶剂（Deep-eutectic Solvent，DES）辅助超声萃取（Ultrasound-assisted extraction，UAE）辣木的总酚和类黄酮含量，提供了一种绿色高效的方法；Molina[14]等用冲击波辅助提取太子参药材中酚酸和类黄酮，与常规溶剂法比，提取效率明显更高；Mai[15]等通过超声辅助萃取和温度诱导浊点提取（Temperatureinduced cloud point extraction，TICPE），开发了一种从大叶黄杨中同时提取和富集类黄酮化合物的绿色方法，具有更高的萃取效率和更好的萃取选择性；Yu[16]等用超声波辅助提取积雪草中类黄酮，显著提高了提取率；Song[17]等用超临界二氧化碳流体萃取新疆枣叶中黄酮类化合物，可得到更高的总类黄酮含量及更强的抗氧化和抗增殖活性。

1.2 酶解提取法

更完全地提取有效成分，必须去掉由果胶质、纤维素和半纤维素及木质素等构成的细胞壁，而采用生物酶解法是专一高效的催化方法。酶不仅用于细胞壁降解，还有利于增加目标化合物的溶解度，增加提取效率。常用的酶如果胶酶（Polygalacturonase）是一组复杂的酶，可降解植物组织中存在的各种果胶类物质[18]，在水果、造纸和纺织工业中具有潜在的应用。Chen等用酶解辅助提取银杏叶中黄酮类化合物，改善了提取效果，提高了提取率[19]；细胞壁降解酶能改善从小球藻中提取脂质的能力[20]；碱预处理再辅助酶处理，能破坏细胞壁并从拟微球藻中提取脂质[21]；纤维素酶增加了稻草糖化过程中酚酸的释放[22]；Wilkins等用纤维素酶和果胶酶水解葡萄柚果皮废料，产生糖，将其用于生产乙醇[23]；Wei等用双酶辅助盐渍法提取草种子中的黄酮，可用于大量生产类黄酮[24]。

1.3 超声波提取法

超声波独具的物理特性能促使植物细胞组织破壁或变形，使有效成分提取更充分，可直接用于提取目标化合物，是一种比较常见的类黄酮提取方法。Qiao等利用超声波声化学作用处理了柑橘中14种类黄酮[25]；Yang[26]等使用结合热回流萃取（Heat Reflux Extraction，HRE）和超声辅助的联用方法（Heat and Ultrasonics-assisted Extraction，HUAE）从半枝莲中提取类黄酮，明确了该方法的优越性。Meng[27]等用超声辅助深共熔溶剂提取黄酮，除了减少了对环境的影响，更提高了提取效率；Belwal[28]等用超声波辅助大规模提取梨果皮中花色苷，用于大批量提取和工业应用。

1.4 超声波辅助酶解提取法

超声波也是酶催化反应的强大工具，可以影响酶和底物的结合，进而改善果胶酶、木聚糖酶和纤维素酶活性[29]。超声通过瞬时空化在介质中产生的强对流而增加了酶促过程中的碰撞次数，并通过增加酶与有机分子之间的相互作用来提高降解效率[30]，因此采用超声波辅助酶解可以有效提高反应效率。低频超声的振幅，反射器的存在，与角的距离和基板的形状均可影响纤维素酶水解的效率[31]。通过超声可增强甘蔗渣的酶解作用，还原糖释放的增加[32]；Subhedar[33]等利用超声波辐照辅助酶促水解生产可发酵糖，进一步生产生物乙醇；Lei[34]等酶解-超声辅助（EUAE）提取甜茶树中的黄酮类化合物；张[35]等采用超声波辅助酶法提取桑葚酒残留物中花色苷，提高了生产效率；Subhedar[36]等利用超声波强化废报纸的酶促水解以生产可发酵的糖，将木质纤维素有效转化为可发酵糖进而生产生物乙醇，超声和酶的组合具有协同作用，可降低对酶和底物结合的扩散限制，并提高反应速率。

2 手性柚皮素的拆分方法

2.1 外消旋柚皮素的分析方法

关于类黄酮功能性成分的外消旋检测前人已经做了较多的研究，较新的检测方法包括：HPLC-DAD[37]、UHPLC-QqQ-MS/MS[38]、UPLC-QTOF-MS[39]等。外消旋柚皮素的检测方法也有一些研究：UHPLC-QqQ-MS/MS[12]、傅里叶变换红外光谱和高效液相色谱-紫外检测-电喷雾电离串联质谱[25]、LC-MS/MS[40]、SM-USA-MSPD-高效液相色谱法联用[41]，均能满足实验需要。

2.2 手性旋柚皮素的拆分方法

目前，对于柚皮素功能方面的研究，均以外消旋体进行。事实上，柚皮素为手性化合物，有两个对映异构体（图2），手性对映体有相同的分子量、熔点、溶解度等，但也存在一些理化性质的差异。手性柚皮素与手性物质相互作用极有可能产生不同的产物，特别是许多与生物体密切相关的生化反应均和物质的手性相关联。而目前尚未有手性柚皮素单体绝对构型的确认及手性单体的功能性研究。这是值得期待的研究领域，特别当一种对映体具有有益的生理活性，而另一种对映体对人体有害时，手性成分研究显得尤为重要。1960年代的“反应停”致畸事件，就是手性化合物其中一个构型引起的惨剧。

图2 手性柚皮素的两个对映异构体

手性柚皮素的仪器拆分方法主要为液相色谱（High performance liquid chromato-graph，HPLC）和液相色谱质谱（High performance liquid chromatography-Mass，HPLC-MS）联用，目前研究进展仅处于对映体的拆分，尚未确定柚皮素R-和S-的绝对构型，作为一个完整的检测方法，均还有待完善。Gaggeri[42]等采用高效液相色谱分离了几种果汁柚皮素，最终确认在手性柱Chiralpak AD-H用纯甲醇（不含酸性或碱性添加剂）洗脱，分离度高，但该方法分离时间长，未做绝对构型和方法学确认。Si-Ahmed[43]等使用苯基氨基甲酸酯-丙基-β-环糊精手性固定相的纳米液相色谱分离了柚皮素，该方法只保证了两个单体的分离，同样未做绝对构型和方法学确认；Wang[44]等开发的高速逆流色谱（Highspeed Countercurrent Chromatography，HSCCC）结合铜(II)-手性离子液体配合物和羟丙基-环糊精，重点做了两个单体的分离，绝对构型和方法学均未做确认，且分离时间长，流动相复杂；Baranowska[45,46]等同时发表了两篇关于柚皮素手性分离的研究，内容比较相似，采用RP-UHPLC-DAD的方法，拆分了对映体单体。

质谱是一种测量离子质荷比（质量-电荷比）的分析方法，其基本原理是使试样中各组分在离子源中发生电离，生成不同荷质比的带电荷的离子，经加速电场的作用，形成离子束，进入质量分析器。在质量分析器中，再利用电场和磁场使发生相反的速度色散，将它们分别聚焦而得到质谱图，从而确定其质量。也就是说，质谱是没办法确认立体结构，只能确定质量，因此，建立完善的手性柚皮素拆分方法具有非常大的必要性和紧迫性。

3 小结

目前，对柑橘类黄酮物质的研究还集中在外消旋混合物的分析和功能验证，对手性类黄酮对映体的单独或差异性研究仍鲜有报道。因此，建议在今后开展以下几个方面的研究：一是在以柑橘类果皮、果肉和全果等为材料的手性柚皮素研究过程中，应采用绿色、高效的复合酶和超声波协同技术，综合考虑温度、pH等对柚皮素溶解度和稳定性的影响[47]，优化最佳的前处理条件，降低目标功能性成分的损失，为精准鉴定评价手性柚皮素。二是开展手性柚皮素单体的功能性验证。通过对柑橘柚皮素进行手性单体制备，开展抗氧化能力差异性评价。三是通过分子生物学技术，开展柑橘类手性柚皮素的基因调控、代谢组学等机理研究，为提高柑橘优质资源开发利用提供理论参考。