陈静妮，代礼平，雷 燕，胡海浩，黄鉴涛，简纪常，闫秀英

（1.广东海洋大学水产学院，广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室/水产经济动物病害控制广东普通高校重点实验室，广东 湛江 524088;2.广州利洋水产科技股份有限公司，广东 广州 510515）

先天性免疫应答是宿主防御病毒感染的第一道屏障，并可激起宿主的获得性免疫反应[1]。在鱼类抗病毒感染的主要免疫应答中，细胞免疫起重要作用。鱼类免疫细胞包括非特异性细胞毒性细胞（nonspecific cytotoxic cell,NCC）、淋巴细胞和吞噬细胞等。鱼类NCC 的功能与哺乳动物自然杀伤（natural killer,NK）细胞相似。通过裂解病毒感染的细胞、寄生虫、肿瘤靶细胞等，NCC 在鱼体免疫反应中有重要作用[2]。非特异性细胞毒性细胞受体蛋白-1（non-specific cytotoxic cell receptor protein 1，NCCRP-1）是NCC 发挥功能的分子基础。有些鱼类的NCCRP-1 是一种典型的Ⅲ型膜蛋白，有的是可溶性蛋白[3]。NCCRP-1 对NCC 的激活有识别、结合靶细胞，激活JAK/STAT 信号通路[7-8]等多重作用[4-6]，因而在硬骨鱼NCC 免疫反应中扮演重要角色[2,9]。在草鱼（Ctenopharyngodon idella）抗呼肠孤病毒（GCRV）感染中，肾脏是重要免疫器官，草鱼NCCRP-1 参与了免疫反应[3]。

白细胞介素-10（interleukin 10,IL-10）是一种主要的抗炎因子，可抑制单核细胞、巨噬细胞等释放炎症介质，并可增强抗炎性因子释放，有下调炎症反应等作用[10]，鱼类单核细胞、T 细胞、巨噬细胞等多种细胞可产生IL-10。在人类、动物、鱼类等均已发现，IL-10 在疾病中起重要作用[11-13]；IL-10可参与病毒致病过程[14-20]。鱼类IL-10 参与免疫调节，在鲤（Cyprinus carpio）、虹鳟（Oncorhynchus mykiss）、斑马鱼（Danio rerio）等头肾中的表达量最高[21-22]，在卡特拉鲃（Catla catla）各组织均有不同程度的表达，感染后2 d 达到表达高峰[23]。

为探索细胞免疫在草鱼抗病毒感染中的作用，本研究对草鱼NCCRP-1和IL-10进行原核表达，制备其多克隆抗体，探讨在重组NCCRP-1 和IL-10 免疫后，草鱼肾脏和肠[3,24]组织病理学变化及NCCRP-1和IL-10 的表达，为开发草鱼出血病新型基因工程疫苗、新型免疫佐剂及免疫治疗等奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

载体pMD18-T，原核表达载体pET-32a，大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α、BL21 购自TaKaRa 公司。成年新西兰兔，2～ 5 kg/只，购自广东医科大学实验动物中心（实验动物质量合格证：0001906），按常规方法喂以饲料、胡萝卜和青菜。草鱼200 尾（约250 g），取自广东省湛江市鹤地水库，随机取目测健康的草鱼10 尾，经显微镜、PCR 和RT-PCR 等检测无任何病原体和疾病症状，认为实验鱼健康。实验鱼于水箱26 ℃下暂养2 周，水体溶解氧、氨、氮和pH 分别是8.1 mg/L、0.1 mg/L、0.03 mg/L 和7.5。

1.2 草鱼NCCRP-1 和IL-10 的原核表达与纯化

根据本课题组前期获得的草鱼NCCRP-1和IL-10基因序列（GenBank 登录号为HQ388293 和HQ388294）[3]，设计含酶切位点的引物（表1），用于扩增NCCRP-1和IL-10的ORF。取草鱼肾脏组织，提取基因组DNA，用PCR 技术获得草鱼NCCRP-1和IL-10的ORF。PCR 扩增体系25 μL，含DNA 模板2 μL、10 μmol/L 引物各1 μL、dNTPs(2.5 mmol/L) 2 μL、10×ExTaqBuffer 2.5 μL、ExTaq酶 (1 U/μL) 0.25 μL、ddH2O 16.25 μL。草鱼NCCRP-1ORF 扩增条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 45 s、57 ℃ 45 s、72 ℃ 1 min，30 个循环；72 ℃下延伸10 min，4 ℃条件下保存。草鱼IL-10ORF 扩增条件除退火温度为52 ℃外，其余同NCCRP-1。

表1 实验所用引物Table 1 Primers used in this study

原核表达方法参照文献[25]，将草鱼NCCRP-1和IL-10的ORF（含酶切位点）插入pET-32a(+)载体（含his 标签），通过菌落PCR、双酶切（BamH I 和SalI）和测序确定正确构建原核表达质粒pET-NCCRP 和pET-IL10。

将重组表达质粒pET-NCCRP 和pET-IL10 分别转入大肠杆菌BL21，挑取生长良好的单菌落接入含50 μg/mL 氨苄的LB 液体培养基，在37 ℃、200 r/min 条件振荡培养12 h，按体积比1∶100 的比例接种到新配制的LB 液体培养基（含氨苄）中，在37 ℃下培养至D(600 nm) 达0.4～ 0.6，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度为1 mmol/L，在37 ℃下振荡培养4 h，以10 000 r/min离心 2 min，收集菌体，通过聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳检测蛋白表达情况，并进一步优化重组融合蛋白NCCRP-1 和IL-10 的表达条件。

将含重组表达质粒（pET-NCCRP 和pET-IL10）的BL21 菌分别接种于200 mL LB 液体培养基（含氨苄）中，经最优诱导条件诱导，经过多重离心和重悬，用8 mol/L 尿素在4 ℃下溶解表达的重组蛋白。将获得的重组蛋白用HisTrap HP 柱按常规方法纯化，分别用30、60、90、120、150、200、250 mmol/L咪唑洗脱缓冲液洗脱，收集逐步洗脱后的融合蛋白，然后进行SDS-PAGE 电泳和转膜，用含50 g/L脱脂牛奶和质量分数0.1%吐温的硫酸盐缓冲液（PBS）室温下阻断1 h，用抗-His 鼠抗（1∶1 000，Invitrogen）4 ℃下孵育16 h，再用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体（1∶3 000，Takara）孵育2 h，曝光显影。按照Bradford 蛋白质定量测定试剂盒（上海生工生物工程有限公司，货号C503031）测定蛋白浓度。

1.3 兔抗草鱼NCCRP-1 和兔抗草鱼IL-10 多克隆抗体的制备及其效价测定

兔抗血清的制备参考文献[25]，阴性对照血清取自未免疫兔。分别将纯化后的重组NCCRP-1和IL-10蛋白 (500 µg) 与完全弗氏佐剂 (Sigma) 混匀呈乳状，在兔后背采用多点注射法将此乳化混合物注入体内。第1 次免疫2 周后，每两周加强免疫1 次，共进行4 次加强免疫。最后1 次加强免疫后8 d，抽取兔子血液，用辛酸-硫酸铵法纯化血清[26]，储存在-20 ℃冰箱备用。用ELISA 方法[25]测定兔抗血清滴度，并采用Western blot[25]检测抗原抗体结合特异性。

1.4 草鱼免疫、攻毒和样品准备

将暂养的实验鱼分为4 组，每组30 尾，其他草鱼备用。对照组1：不进行免疫和攻毒；实验组1：每尾注射200 μL 免疫混合液1（含24 μg 重组NCCRP-1 的质量分数0.7%生理盐水与弗氏完全佐剂体积比为4∶1）；实验组2：每尾注射200 μL 免疫混合液2（含24 μg 重组IL-10 的质量分数0.7%生理盐水与弗氏完全佐剂体积比4∶1）；对照组2：每尾注射200 μL 佐剂混合液（质量分数0.7%生理盐水与弗氏完全佐剂体积比4∶1）。免疫后24 h 用约2 000 μg/mL GCRV GD108 对实验组1、实验组2 和对照组2 进行攻毒感染，剂量为150 μL/尾[25]。感染7 d 后，每组随机取草鱼3 尾，分别剖取肾脏和肠道组织，进行定量PCR、Western blot 和病理切片制作。

1.5 定量PCR 和Western blot

将3 尾草鱼部分肾脏和肠道组织分别混合，提取RNA，进行定量PCR，重复3 次。定量PCR 内参基因为β-actin和GAPDH，引物为actinF、actinR、GAPDHF 和GAPDHR（表1）。目的基因NCCRP-1和IL-10的定量PCR 引物为NCCRPF、NCCRPR、IL-10F 和IL-10R（表1）。定量PCR 体系（25 μL）：SYBR®Premix ExTaqTM12.5 μL，每条引物0.5 μL(10 pmol/L)，cDNA 2 μL，ddH2O 9.5 μL。反应条件：95 ℃ 3 min，然后95 ℃ 10 s、55 ℃（IL-10，54 ℃）30 s，40 个循环。用2-ΔΔCt法[27]处理定量PCR 数据，进行配对t检验，用SPSS15.0 软件对数据进行统计分析，P＜ 0.05 时有显著差异。

用预冷的质量分数0.7%生理盐水快速洗涤摘取的部分肾脏和肠道组织，快速放入液氮，然后于冰上进行超声匀浆（避免起泡），匀浆时加入预冷的生理盐水4.5 mL。组织匀浆中迅速加入预冷的100 μL 尿素缓冲液（100 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0；8 mol/L 尿素）和1 μL 蛋白酶抑制剂PMSF，反复吹打，细胞充分裂解后以4 ℃、12 000g条件离心10 min，收集上清液保存于-80 ℃。采用Bradford蛋白质定量测定试剂盒测定总蛋白浓度，确保SDS-PAGE 电泳上样蛋白总量一致。对肾脏和肠道中的NCCRP-1 和IL-10 进行Western blot 检测[25]，一抗为上述的抗血清和兔抗GAPDH（1∶5 000，Thermo Fisher，上海），二抗为山羊抗兔（1∶30 000，Takara，大连）。孵育抗体时先进行目的蛋白的抗体孵育、显色和检测，然后使用Strip 缓冲液洗去膜上抗体，再进行内参蛋白GAPDH 的抗体孵育、显色和检测。

1.6 组织病理切片制作

分别取草鱼部分肾脏和肠道组织，用质量分数0.7%的生理盐水清洗，于Bouin 氏固定液中固定8 h，用流水洗去固定液。使用不同浓度的乙醇逐级脱水，按常规石蜡法[28]包埋切片，厚度5～ 6 μm；采用HE 染色、中性树胶封片。用光学显微镜观察组织病理切片并拍照。

2 结果与分析

2.1 草鱼NCCRP-1 和IL-10重组蛋白的表达与纯化

草鱼NCCRP-1的ORF 为714 bp (GenBank 登录号HQ388293)，编码237 个氨基酸，预测其分子质量7.3 ku，等电点为5.63。草鱼IL-10的ORF 为540 bp (GenBank 登录号HQ388294)，编码179 个氨基酸，预测其分子质量为21.0 ku，等电点为8.34。

草鱼NCCRP-1和IL-10的ORF 与表达质粒pET-32a 连接后，重组表达质粒pET-NCCRP 和pET-IL10 经菌落PCR 鉴定、双酶切鉴定（图1）和测序验证，重组表达质粒构建正确。

图1 重组表达质粒 pET-NCCRP 和pET-IL10 双酶切Fig.1 Enzyme restriction of the recombinant expression plasmid pET-NCCRP and pET-IL10

重组表达质粒pET-NCCRP 和pET-IL10 转化至大肠杆菌BL21 的最优表达条件分别为0.1 mmol/L IPTG 37 ℃诱导4 h、1.0 mmol/L IPTG 37 ℃诱导6 h。重组表达质粒pET-NCCRP 表达的融合蛋白分子质量为47.8 ku（含融合标签分子质量20.5 ku）（图2）；含空质粒pET-32a 的BL21 菌体诱导后表达出20.5 ku 的融合标签；未经诱导的含空质粒pET-32a和重组表达质粒pET-NCCRP 的BL21 菌体均未表达出目的蛋白（图2）。重组表达质粒pET-IL10 表达的融合蛋白分子质量为41.5 ku（含融合标签分子质量20.5 ku）（图2）；含空质粒pET-32a 的BL21菌体诱导后表达出20.5 ku 的融合标签；未经诱导的含空质粒pET-32a 和重组表达质粒pET-IL10 的BL21 菌体均无表达出目的蛋白（图2）。表达的融合蛋白经纯化、不同浓度的咪唑缓冲液洗脱和电泳检测（图3），发现200 mmol/L 咪唑的纯化效果最佳，纯化后重组蛋白NCCRP-1 和IL-10 质量浓度分别为690、520 μg/mL。

图2 pET-NCCRP 和pET-IL10 在大肠杆菌中的表达Fig.2 Expression of pET-NCCRP and pET-IL10 in E.coli BL21

图3 pET-NCCRP 和pET-IL10 重组蛋白的纯化Fig.3 Purification of recombinant proteins pET-NCCRP and pET-IL10

2.2 兔抗草鱼NCCRP-1 和IL-10 多克隆抗体效价

ELISA 检测表明，NCCRP-1 和IL-10 均产生1∶40 000 的高效价特异抗体。western-blot 结果表明，NCCRP-1 抗血清可与重组蛋白发生抗原抗体反应，在48 ku 处有印迹条带（目的蛋白）（图4）；IL-10抗血清也可与重组蛋白发生特异性结合，在41 ku处有印迹条带（目的蛋白）（图4）。

图4 融合蛋白NCCRP-1 和IL-10 的免疫印迹Fig.4 Western blot of the fusion proteins NCCRP-1 and IL-10

2.3 NCCRP-1 和IL-10 在肾脏和肠中的表达

免疫和感染后，NCCRP-1 和IL-10 在mRNA和蛋白水平检测结果见图5、6。图5 表明，在肾脏和肠中，实验组1 NCCRP-1 表达量最大，且实验组1 与其他组差异显著（P＜ 0.05）；实验组1 与对照组1、对照组2 的表达也有显著差异；NCCRP-1 在肾脏中表达量比肠中高。Western blot 结果（图5）也可证明NCCRP-1 表达的差异。IL-10 定量PCR、Western blot 结果（图6）表明，在肾脏和肠中，实验组2 的表达高于其他组，但无显著差异（P＞ 0.05）。

图5 NCCRP-1 在肾脏和肠中的表达Fig.5 Expression of NCCRP-1 in kidney and intestine

图6 IL-10 在肾脏和肠中的表达Fig.6 Expression of IL-10 in kidney and intestine

2.4 组织病理学观察

图7 为部分病理切片结果。对照组1（未免疫未攻毒）草鱼肾脏和肠无病理变化；实验组1（重组NCCRP-1 免疫和GCRV GD108 攻毒）草鱼肾小管上皮基部轻微水肿，肾脏和肠轻微出血；实验组2（重组IL-10 免疫和GCRV GD108 攻毒）草鱼肾小管上皮水肿，有淋巴细胞散在坏死，肾脏和肠固有层出血；对照组2（未免疫和GCRV GD108 攻毒）草鱼肾脏出血，肾小管上皮基部水肿，肾小管上皮有红色团块，肠固有层严重出血和散在细胞坏死。可见，NCCRP-1 免疫组、IL-10 免疫组、未免疫组的组织出血程度由轻变重、坏死从无到有、水肿程度由轻到重，即组织病理变化逐渐严重，因此，重组NCCRP-1 和重组IL-10 免疫对草鱼抗GCRV GD108 感染有一定效果；而重组IL-10 免疫后草鱼出血和水肿程度介于NCCRP-1 免疫组和未免疫组之间，因此免疫效果不显著。

图7 草鱼肾脏和肠的组织病理切片Fig.7 Pathological sections of kidney and intestine of grass carp

续图7（Continued）

3 讨论

细胞免疫是鱼类防御病毒感染的重要防线。NCCRP-1 和IL-10 在不同细胞免疫应答中发挥关键作用。本研究成功对草鱼NCCRP-1和IL-10基因进行原核表达，纯化获得目的蛋白，制备高效价的免疫血清，并通过组织病理切片和表达变化分析NCCRP-1 和IL-10 在抗病毒感染中的作用。

草鱼感染GCRV 后，NCCRP-1在各组织中表达量均上调，在肾脏中上调最大，在肠中次之[3]。GCRV GD108 基因型属于GCRV Ⅱ型，主要临床症状是肠道出血，呈现“肠炎型”症状[3,8]。其感染草鱼7 d 后，NCCRP-1在草鱼肾脏中表达上调至峰值[3]。因此，本研究分析免疫草鱼在感染GCRV GD108 7 d 时的肾脏、肠组织病理切片，以及NCCRP-1 和IL-10 表达。

组织病理学分析表明，用重组NCCRP-1 和重组IL-10 免疫对草鱼抗GCRV GD108 感染有一定效果，重组NCCRP-1 免疫后病理变化较轻，Yan 等[3]的研究亦表明NCCRP-1 参与了抗GCRV 感染的免疫反应；IL-10 在炎症和自身免疫疾病中发挥重要作用[10]，但重组IL-10 免疫后病理变化较重，可能与GCRV 的致病机制等有关。

本研究表明，GCRV GD108 感染后，NCCRP-1表达在mRNA 和蛋白水平均上调（图5），与其他研究[3,29]一致。Chaves-Pozo 等[29]研究表明，海鲷（Sparus aurata）和海鲈（Dicentrarchus labrax）感染野田村病毒（Viral nervous necrosis，VNN）后NCCRP-1的表达上调。NCCRP-1的表达上调与NCC 的杀伤机制相关[30]。NCCRP-1的表达可激活NCC，进而刺激细胞因子的释放，裂解病毒感染的细胞[29-30]。本研究中，用重组NCCRP-1 免疫以及GCRV GD108 攻毒后，草鱼NCCRP-1的表达量最大，推测外源NCCRP-1 可能诱导内源性NCCRP-1的产生，NCCRP-1 也可能是良好的免疫增强剂，因而促进了草鱼NCCRP-1的表达，从而增强草鱼抵御病毒感染的免疫应答。总之，从定量PCR、western blot 和组织病理学综合分析可见，NCCRP-1 在草鱼抗GCRV 感染过程中发挥着作用。关于鱼类NCC和NCCRP-1 抵御病毒感染作用机制还有待深入研究。此外，细胞因子在抗感染方面有重要作用。外源重组细胞因子可在机体内发挥免疫佐剂作用，已在许多病毒疫苗中发挥出良好的免疫增强作用，还可提高疫苗的保护率，提高机体对疫苗的免疫应答，提高病毒蛋白的免疫原性等[31-32]。本研究中，重组NCCRP-1 也可能是作为外源重组细胞因子在GCRV 感染中发挥了作用。

IL-10 表达相对于NCCRP-1 上调不显著，而且重组IL-10 免疫组（实验组2）有较重的病理变化，说明其在GCRV 感染中抗病毒效果不明显。虽然IL-10 有调节免疫平衡、释放免疫介质、抗原呈递等作用[10]，且已发现IL-10 在病毒感染中发挥作用，如HPV (human papilloma virus) 感染后，在HPV E2、E6 和E7 的作用下IL-10的表达上调[19]，KSHV（Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus）编码的miR-K12-3 可减少IL-10 的表达来促进肿瘤的发展[20]，在大西洋鲑（Salmo salarL.）感染SAV(Salmonid alphavirus) 过程中IL-10表达上调[15]，鳜（Siniperca chuatsi）感染ISKNV（infectious spleen and kidney necrosis virus）后IL-10表达显著上调[16]；但本研究中，免疫和攻毒后，草鱼IL-10表达变化不显著，或与草鱼IL-10 的作用和炎性反应相关。草鱼IL-10 在GCRV 感染中的作用及GCRV 的感染机制有待进一步研究。

综上，本研究对原核表达的草鱼NCCRP-1 和IL-10 蛋白进行纯化，制备两者的高效价兔抗血清；重组NCCRP-1 和IL-10 免疫以及GCRV GD108 感染草鱼后，草鱼肾脏和肠组织病理切片分析，以及NCCRP-1、IL-10 的表达分析表明，外源NCCRP-1可能诱导内源性NCCRP-1 的产生，也可能是作为良好的免疫增强剂而增强草鱼抵御病毒感染的免疫应答，因此，NCCRP-1 在草鱼抗GCRV 感染过程中发挥作用；而IL-10 对GCRV 的抗感染作用不显著，具体机制有待进一步研究。本研究可为开发草鱼出血病新型基因工程疫苗、新型免疫佐剂等提供依据。