唐清兰，周 利，徐姿静

(四川剑南春集团有限责任公司，四川绵竹 618200)

大曲在浓香型白酒酿造中起着接种微生物、投粮、糖化发酵和生香的作用，它的质量好坏直接影响到白酒的产量和质量，是传统固态白酒酿造的物质基础[1-2]。由于大曲的制作过程是敞开式、自然接种，且制曲过程长达数月，因此富集在其中的微生物种类和数量与环境、水分、温度等条件息息相关。因此，大曲培养过程是一个复杂的微生物动态变化过程，微生物种类和数量在此过程中此消彼长，赋予了大曲糖化、发酵和生香等功能，为酿酒发酵提供动力[3-4]。

大曲微生物主要有细菌和真菌两大类，其中真菌在酿酒过程的产酒、产酶、产香等方面起到重要作用，因此大曲真菌的研究是酿酒微生物体系研究中不可忽视的环节[5]。随着现代分子生物技术的发展，高通量测序等技术广泛应用于大曲微生物的研究，该方法可以检测到相对丰度较低的微生物以及不可培养的微生物，克服了传统可培养技术操作繁琐、准确性差、局限性大等缺点，能够客观地认识大曲复杂的微生物群落结构及其变化规律，挖掘更多的生物学信息[6-8]。施思等[9]利用高通量测序对浓香型大曲贮藏阶段的真菌多样性进行分析，发现大曲真菌群落结构不断变化，毕赤酵母属、根霉属和恒梗霉属为最终优势菌群。夏玙等[10]研究了贮藏期不同干燥方式和不同储存方式对大曲真菌群落的影响。吴树坤等[11]对四川不同地区的浓香型大曲微生物群落结构进行比较，发现不同区域的微生物群落结构确实存在差异，遂宁大曲的真菌多样性比宜宾和泸州的要丰富。目前，很多关于浓香型白酒大曲真菌微生物群落结构的报道都集中在大曲制曲过程的某个阶段或某个时间点上，而本实验则是跟踪研究浓香型白酒大曲整个制曲过程，在不同时间点取样分析，剖析浓香型白酒大曲从入房发酵到成品可用这个过程的真菌微生物群落结构变化，为生产优质浓香型大曲和揭示浓香型白酒微量风味物质形成原因提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

曲样：剑南春不同制曲阶段大曲。

耗 材：引 物ITS1F（CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA），引物ITS2R（GCTGCGTTCTTCATCGATGC），Soil DNA Kit试剂盒（OMEGA）。

1.2 实验方法

浓香型大曲曲醅压制成型后堆入房间进行培菌，在第2 d、5 d、12 d、24 d 取样，分别命名为N_2d、N_5d、N_12d和N_24d；接着多层堆码进行入库储存，此阶段在入库、贮存1 个月、贮存3 个月3 个时间点取样，分别命名为N_R、N_Z1 和N_Z3，储存结束后可用于酿酒生产的是成品曲，取样并命名为N_C。整个过程共取样8 个，所有样本在取样后立即用干冰冷冻。

采用引物ITS1F 和ITS2R 对真菌ITS 区进行扩增，并高通量测序，每个样品做3 个平行，进行真菌微生物群落结构的多样性分析。

2 结果与分析

2.1 稀释曲线（图1）

图1 稀释曲线

图1 是以Chao 指数来反映本实验中浓香型白酒大曲不同制曲阶段样本的真菌稀释曲线，Chao指数常用来估计物种总数。本实验对8 个不同发酵期的浓香型大曲进行测序，在97%相似度的OTU 水平进行Chao 指数计算，每个样本的测序深度为43757 条序列。由图1 可以看出，随着测序深度增加，Chao 指数曲线逐步趋于平缓，说明本实验测序数据量足够大，可以代表样本的真菌微生物多样性信息。

2.2 多样性指数（表1）

表1 Alpha多样性指数

表1 为浓香型白酒大曲不同制曲阶段真菌Alpha 多样性指数，本试验通过Coverage、Shannon、Simpon、Ace 和Chao 5 个指标对大曲真菌群落Alpha 多样性进行分析。可以看出，各样本Covergae≥0.9997，说明本次测定结果能够真实地反映样本中真菌的多样性。不同制曲阶段的大曲真菌多样性指数均存在差异，Shannon 和Simpson 反映样本中真菌物种多样性，结果表明，物种种类在制曲过程中不断变化。Ace 和Chao 指数反映样本中真菌群落的丰富度，可以看出，随着时间延长，真菌丰富度呈先下降后缓慢增加的趋势。综合分析，发酵12 d 到入库这个阶段是制曲转折期，此阶段因为大曲温度升高、水分下降等原因，生长条件变得严苛，不适合生长的微生物不断消亡，而利于生长的微生物逐步富集。

2.3 不同制曲阶段Venn图（图2）

图2 属水平下不同制曲阶段大曲Venn图

图2 是属水平下不同制曲阶段浓香型白酒大曲的真菌Venn 图，重叠部分的数字代表不同制曲阶段的大曲共有物种数量，非重叠部分的数字代表各阶段特有物种数量，由图2 可知，有12 种真菌微生物为各阶段所共有，其中第2 天和第12 天特有物种数分别为6 种和4 种，其他阶段特有物种数≤2，说明整个制曲阶段真菌微生物种类进行着动态变化，但多数微生物种类保持一致。

2.4 真菌群落结构分析

2.4.1 门水平下真菌群落结构分析（图3）

图3 门水平下不同制曲阶段大曲真菌组成图

图3 是门水平下不同制曲阶段浓香型白酒大曲真菌组成图，可以看出子囊菌门（Ascomycota）占有绝对优势，丰度值均在98.8%以上，毛霉菌门（Mucoromycota）在不同制曲阶段均被检出，但是含量极低。

2.4.2 属水平下真菌群落结构分析（图4）

图4 为浓香型白酒大曲不同制曲阶段在属水平上的真菌群落组成图。伊萨酵母属（Issatchenkia）、嗜热子囊菌属（Thermoascus）、曲霉属（Aspergillus）、假丝酵母属（Candida）、嗜热真菌属（Thermomyces）、红曲霉属（Monascus）、粉状米勒氏酵母属（Millerozyma）、酿酒酵母属（Saccharomycopsis）均被检出。其中，伊萨酵母属（Issatchenkia）、嗜热子囊菌属（Thermoascus）、曲霉属（Aspergillus）分别在制曲过程不同时期占据主导地位。

图4 属水平下不同制曲阶段大曲真菌组成图

伊萨酵母属（Issatchenkia）广泛存在于酿酒生产中，有较高的产乙醇和产酯能力。该菌在发酵前12 d 占主导地位，第2 天丰度值最高，为89.6%，之后逐步降低，第12 天降为59.5%，后面几个阶段均较低，储存1 个月、3 个月丰度分别为8.4%和1.5%。分析出现此现象是因为培养初期大曲温度较低、水分适中，适于酵母菌的生长繁殖，因此数量较高，随着发酵进行，大曲温度升高，水分减少，不利于酵母菌的生长，酵母菌数量急剧下降。

嗜热子囊菌属（Thermoascus）和嗜热真菌属（Thermomyces）均是嗜热菌，该类微生物耐高温，其最低生长温度为20 ℃或20 ℃以上，最高生长温度为50 ℃或50 ℃以上，可产生嗜热酶，包括纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等，这些嗜热酶在高温条件下保持极好稳定性，有利于大曲产酒生香作用。浓香型大曲为中高温大曲，在制曲阶段温度可到50 ℃以上，这为嗜热真菌的生长和繁殖提供了良好条件，有研究发现，嗜热真菌广泛存在于浓香型大曲中[12-14]。其中，嗜热子囊菌属（Thermoascus）在发酵第5 天开始出现，发酵24 d 时丰度最高，可达94.1%，随后降低，最后成品曲中达46.4%。嗜热真菌属（Thermomyces）在第12、24 天，入库3 个月和成品曲中丰度值分别为2.6%、3.1%、4.3%和0.9%，其他阶段几乎未被检出。嗜热菌的存在正体现了制曲温度对大曲品质的影响。

曲霉属（Aspergillus）是大曲中种类众多的一类微生物，耐糖和耐盐能力强，糖化酶系发达，主要为大曲提供糖化力、液化力、蛋白质分解能力及多种有机酸等物质。整个阶段其数量几乎呈增加趋势，储存3 个月时达到高峰，丰度为74.4%，成品曲中达52.3%。

假丝酵母属（Candida）具有产乙醇和产香能力，能发酵生成多元醇和呋喃酮类，丰度在整个发酵期呈下降趋势，在第2、5、12 天分别为9.4%、1.7%和2.6%，其他阶段含量极低。

红曲霉属（Monascus）为腐生真菌，嗜乳酸，能产生糖化酶、淀粉酶，也能产生辛酸、癸酸、月桂酸、豆蔻酸、油酸、亚油酸以及相应乙酯等微量成分，对发酵产物的风味和质量有利。本研究发现，该微生物在制曲第5 天和第12 天被检出，丰度值分别为1.7%和0.7%。

粉状米勒氏酵母属（Millerozyma）呈瓜子椭圆形，菌落呈白色，该菌具有一定的耐盐性，能产生醇类和酮类等物质。仅在第12 天被检出，丰度值为2.3%。

酿酒酵母属（Saccharomycopsis）在自然界分布甚广，发酵过程主要产乙醇，同时还能生成多种有机酸、高级醇和酯类物质，这些物质在白酒的风味中发挥重要作用。该菌在第12 天时丰度相对较高，为1.5%，其他阶段较低。

综上分析，伊萨酵母属（Issatchenkia）、嗜热子囊菌属（Thermoascus）、曲霉属（Aspergillus）为主导优势菌。伊萨酵母属（Issatchenkia）在制曲发酵期丰度高，而嗜热子囊菌属（Thermoascus）和曲霉属（Aspergillus）在储存和成品阶段数量较多。由此可知，制曲整个阶段前期是接种酵母属，为大曲的酿酒和生香提供菌源，制曲后面阶段主要是耐高温和曲霉类微生物的生长，为大曲提供糖化、液化以及生香相关的微生物。

3 结论

本研究运用高通量测序技术，解析了浓香型白酒大曲整个制曲过程中的真菌菌群结构变化。发现门水平下，子囊菌门（Ascomycota）占有绝对优势；属水平下，伊萨酵母属（Issatchenkia）、嗜热子囊菌属（Thermoascus）、曲霉属（Aspergillus）分别在制曲过程不同时期占据主导地位。通过群落结构的动态演变过程，可以剖析浓香型白酒大曲的糖化、发酵和生香等功能与微生物间的潜在关系。该技术的应用，大大提高了对大曲微生物认识的深度和宽度，对生产优质大曲和酿造优质白酒具有重要意义。