张 超, 施 洋, 刘 咏, 张 强, 王军辉

(1.合肥工业大学 食品与生物工程学院,安徽 合肥 230601; 2.功能性复合调味品安徽省重点实验室,安徽 界首 236500)

三棱(RhizomaSparganii)是我国中药界常用的一味中药,属于被子植物门(Angiospermae),单子叶植物纲(Monocotyledoneae),禾本目(Poales),黑三棱科(SparganiaceaeHanin)[1]。其味辛、苦,性平,具有破瘀、行气、消积、止痛等功效,现已广泛应用于心脑血管疾病、胸痹心痛、瘀血经闭、食积胀痛等病症,同时作为抗癌药物在医学上也得以应用[2]。研究表明,三棱中含有有机酸、多糖、甾醇类、挥发油、黄酮类和矿物盐等丰富的化学成分,其中多糖的含量尤为丰富,是三棱中的主要活性化学成分[3]。多糖作为一种免疫调节剂,在免疫功能的调节、癌症的诊断与治疗、抗衰老及解除机体疲劳等方面都有着重要作用[4]。目前关于三棱多糖的理化特性及活性的研究较少,仅有一些关于三棱中化学成分的提取以及中药三棱药理研究方面的报道[5-7]。

有文献报道,从材料中不同部分所获得的多糖在理化性质、活性等方面存在差异[8]。为了深入了解三棱中多糖的组成及特性,本文在课题组前期工作基础上,采用热水、螯合剂、1.0 、4.0 mol/L NaOH 4种溶剂从三棱根茎中依次获得了三棱热水提多糖(RSB)、三棱螯合剂提多糖(RSC)、三棱稀碱提多糖(RSDA)、三棱浓碱提多糖(RSCA)4种多糖组分,并进一步采用物理和化学方法检测各多糖片段的理化特性并比较其活性差异,为三棱多糖的精细化加工及资源的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

中药三棱(购自河北省安国同源堂)经高速药物粉碎机粉碎,用体积分数为95%的乙醇脱色脱脂后烘干备用。其他试剂有三氯甲烷、NaCl、正丁醇、KBr、苯酚、硫酸、考马斯亮蓝G250、抗坏血酸(Vc)、FeSO4、水杨酸、ABTS、FeCl2、醋酸、DPPH试剂、二甲基亚砜、乙酸酐、吡啶、过氧化氢、EDTA-Na2等。

1.2 三棱多糖的提取

秤取100 g中药三棱粉末,按料液比1∶30热水提取3 h。提取液经过滤(残渣收集)、浓缩、离心、醇沉后得到多糖沉淀。将沉淀复溶于蒸馏水中,用Sevag试剂(V(三氯甲烷)∶V(正丁醇)=1∶5～1∶4)脱蛋白后并以自来水透析3 d,去离子水透析2 d,将透析液冻融、离心、冷冻干燥得到RSB,多糖得率为0.5%。

热水提残渣用0.05 mol/L EDTA和0.05 mol/L草酸钠溶液在pH值为5.8,100 ℃的条件下提取2 h,按照上述实验步骤操作得到RSC,多糖得率为1.2%。

螯合剂提取残渣在1.0 mol/L NaOH/20 mmol/L NaBH4溶液中室温下提取2 h,用醋酸中和滤液后按照上述实验步骤得到RSDA,多糖得率为5.7%。

1 mol/L碱提残渣在4 mol/L NaOH/20 mmol/L NaBH4溶液中室温下提取2 h,用醋酸中和滤液后同样按照上述实验方法得到RSCA,多糖得率为2.8%。

1.3 三棱多糖理化性质分析

1.3.1 化学成分测定

参照文献[9-10],将多糖转化成糖醇乙酸酯后进行气相色谱(gas chromatography,GC)分析。检测条件设定如下:N2流速为20 mL/min,H2流速为30 mL/min,空气流速为200 mL/min,柱温230 ℃,检测器温度250 ℃,气化室温度280 ℃。根据标准单糖的滞留时间判定多糖样品的单糖组成,以峰面积计算各单糖的摩尔分数。

三棱多糖摩尔分数采用苯酚硫酸法测定[11],蛋白质摩尔分数采用考马斯亮蓝法检测[12],糖醛酸摩尔分数采用咔唑法进行检测[13]。

1.3.2 热特性分析

称取5 mg干燥样品,利用热重分析仪(thermal gravimetric analyzer,TGA)对提取的多糖样品进行分析。设定温度范围为35～800 ℃,加热速率为10 ℃/min,保护气(N2)流量为50 mL/min,吹扫气(O2、N2)流量为20 mL/min。

1.3.3 红外光谱分析

称取待测多糖样品1 mg同溴化钾充分研磨后,在红外灯下加热、压片。将制备好的透明薄片放入傅里叶变换红外光谱仪(Fourier transform infrared spectrometer,FTIR)中扫描,扫描范围为4 000～400 cm-1。

1.3.4 三棱多糖显微结构测定

使用场发射扫描电子显微镜(field emission scanning electron microscope,FESEM)测定三棱多糖的显微结构。将样品处理后固定在载玻片上于5 kV电压下观察多糖的微观结构。

1.4 生物活性测定

1.4.1 抗氧化活性

依据文献所提到的方法设定不同质量浓度梯度的样品溶液[14-16],分别测定多糖对DPPH自由基、羟基自由基以及ABTS自由基清除的能力。

1.4.2 免疫调节活性

将小鼠巨噬细胞株RAW 264.7细胞在DMEM培养基(含10%小牛血清,100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素)中置于37 ℃,5% CO2条件下的培养箱中培养。用DMEM培养液将细胞稀释至1.0×105个/mL,取150 μL细胞液于96孔板中,贴壁培养24 h,加入50 μL质量浓度分别为20、50、100、200、500 μg/mL的多糖溶液,培养24 h后分别加入20 μL 质量浓度为5 mg/mL的MTT试剂,混匀,继续培养4 h,移去上清液,加入200 μL DMSO,振荡10 min后用酶标仪在570 nm下测定吸光度值。

为测定RAW264.7细胞的NO产生量,用DMEM培养液将细胞稀释至1.0×105个/mL。取150 μL细胞液于96孔板中,培养24 h后分别加入50 μL质量浓度分别为20、50、100、200、500 μg/mL的多糖溶液,培养24 h后分别取100 μL细胞上清液于96孔板中,向板中加入Griess试剂,静置10 min后用酶标仪在540 nm下测定吸光度值。

同样按照上述实验方法,移除已培养48 h后的细胞上清液,用PBS清洗后加入100 μL中性红染色液继续培养4 h,移除多余的中性红溶液,PBS冲洗2次,加入细胞裂解液,放置1 h后用酶标仪在540 nm下测定吸光度值。

空白对照组为DMEM培养基,正对照为脂多糖(LPS),每组实验均有6个复孔。

1.5 数据处理

采用Origin 9.1软件绘制图表,利用SPSS 24.0软件进行数据统计处理,*表示P<0.05差异显著,**表示P<0.01差异极显著。

2 结果分析

2.1 三棱多糖的理化特性分析

三棱多糖的化学成分分析结果见表1所列。由表1可知,4种组分的化学成分差异显著。其中RSB、RSC、RSDA、RSCA的总碳水化合物摩尔分数分别为54.51%、70.01%、85.36%、88.44%,糖醛酸摩尔分数为5.43%、3.16%、0.59%、0.38%。与RSB和RSC相比,碱提组分中的蛋白质摩尔分数更低,其中在RSCA中未检测到蛋白质的存在。单糖组成分析结果表明RSB与RSC中均含有阿拉伯糖、鼠李糖、木糖、葡萄糖4种单糖,其中葡萄糖摩尔分数最高,分别为84.85%和78.89%。碱提组分RSDA中含有16.53%的甘露糖,但在RSB与RSC中未检测到甘露糖存在,推测可能由于在碱性环境下,破坏了三棱中细胞壁结构,使得细胞壁中的甘露糖成分溶于提取液中。碱提组分(RSDA、RSCA)中未检测到鼠李糖存在,且4种组分中均不含有半乳糖。

表1 三棱多糖化学成分及其摩尔分数 单位:%

三棱多糖的FTIR谱图如图1所示。

图1 多糖RSB、RSC、RSDA、RSCA的FTIR谱图

从图1可以看出,4种组分均有显著的多糖结构。根据文献资料对各样品吸收峰进行分析[17-20],在3 400 cm-1处的吸收峰为糖环的O—H伸缩振动,2 925 cm-1处的吸收峰归因于—CH2—基团的C—H伸缩振动,1 420～1 385 cm-1处的吸收峰归因于C—H的变角振动,1 073 cm-1处归因于吡喃糖环中C=O伸缩和变角振动。此外,RSB与RSC在1 740 cm-1处有明显的吸收峰,说明这2种多糖中含有糖醛酸。

多糖RSB、RSC、RSDA、RSCA在同一放大倍数下的微观结构如图2所示。

图2 多糖RSB、RSC、RSDA、RSCA的FESEM图

从图2可以看出，RSB与RSC在放大200倍条件下呈现出块状或片状结构,而碱提组分则呈现出疏松的孔状或网络状结构。可能在碱性环境下多糖间化学键被破坏,其表面形态呈多孔状网络布局。该结构与水提组分相比更加疏松,且多糖的稳定性更容易受到外界环境因素影响。

4种组分的热重(thermogravimetric,TG)分析曲线如图3所示,从图3可看出,热分解的第1阶段主要集中在35～175 ℃,RSB、RSC、RSDA、RSCA在此阶段中主要损失为多糖中的结合水以及易热分解化合物,质量损失率依次为11.64%、11.03%、5.41%、9.03%,其中RSB分解速率最快,RSDA分解速率最慢;热分解的第2阶段为175～800 ℃,在该阶段中4种多糖的化学键被破坏,多糖因高温分解,RSB、RSC、RSDA、RSCA在此阶段中的质量损失率依次为66.44%、68.68%、72.51%、73.45%。比较4种组分的热重分析结果发现RSB与RSC质量损失速度开始减缓时的温度要高于RSDA、RSCA组分,说明多糖RSB、RSC比碱提组分(RSDA、RSCA)的结构更稳定。这可能是由于碱提多糖中聚合物含量较低,存在大量短链糖以及多侧链糖且结构比水提组分更加疏松，从而使多糖更易受热分解。

图3 多糖RSB、RSC、RSDA、RSCA的TG分析

2.2 三棱多糖的活性分析

2.2.1 抗氧化活性研究

三棱多糖的抗氧化活性结果如图4所示。从图4可以看出,4种多糖组分的抗氧化活性均呈现出质量浓度依赖性,且活性大小随着多糖质量浓度增加而增大,当多糖质量浓度为5 mg/mL时自由基清除率达到最高。通过比较4种多糖的抗氧化活性结果可以看出,RSB在DPPH自由基(图4a)、羟基自由基(图4b)、ABTS自由基(图4c)的清除能力上均表现最佳,最高自由基清除率依次可达到81.47%、80.80%、52.57%。而RSCA的抗氧化活性在4种组分中表现最差,最高自由基清除率依次为61.21%、63.24%、37.52%。RSDA组分在ABTS自由基的清除能力上略高于RSC组分,但在DPPH自由基与羟基自由基的活性数据上低于RSC组分。总体而言,多糖RSB、RSC与碱提组分(RSDA和RSCA)相比具有更高的抗氧化活性。推测碱性环境下多糖的结构可能被破坏,从而导致4种组分的抗氧化活性结果产生显著差异。

图4 多糖RSB、RSC、RSDA、RSCA的抗氧化活性

2.2.2 免疫活性分析

多糖组分RSB、RSC、RSDA、RSCA的免疫调节活性结果如图5所示。从图5a可以看出，当多糖在不同质量浓度条件下，4种组分对巨噬细胞的增殖活性有不同的影响。其中RSDA与RSCA的细胞增殖活性呈现出质量浓度依赖性，增殖指数随着质量浓度的升高而增大，当多糖质量浓度为500 μg/mL时，其对应的增殖指数达到最大值，分别为1.61、1.49。RSB与RSC对巨噬细胞增殖活性的影响呈现先增强后减弱的趋势，当多糖质量浓度为200 μg/mL时,增殖指数达到最大值，分别为1.56、1.51。

图5 4种多糖组分对巨噬细胞RAW264.7免疫活性的影响

从图5b可以看出，多糖组分RSC、RSDA与RSCA的NO释放量在实验质量浓度范围内呈现出质量浓度依赖性，随着质量浓度的升高NO释放量增加，当多糖质量浓度为500 μg/mL时NO释放量达到最大值，分别为3.21、3.56、2.68。RSB的NO释放量在各质量浓度条件下均高于其他3组，在多糖质量浓度为200 μg/mL时NO释放量达到最大值为3.62。从图5c可以看出，4种多糖组分均在不同程度上促进了巨噬细胞RAW264.7对中性红的吞噬能力。RSC与RSCA对巨噬细胞吞噬活性的影响呈现先增强后减弱的趋势，在多糖质量浓度为100 μg/mL时吞噬活性最佳，而RSB与RSDA在多糖质量浓度为200 μg/mL时表现出最佳的吞噬活性。

通过比较多糖组分RSB、RSC、RSDA、RSCA的免疫活性结果,发现碱提组分RSDA与水提组分RSB对巨噬细胞的免疫活性影响要优于其他2种组分,其中碱提组分RSDA的效果最佳。细胞的生物活性与多糖的分子量、支化度、化学结构和链构象等因素有关[21]。而与水提组分相比碱提多糖中聚合物含量低,短链糖以及小分子多糖等化合物含量较高,由于在不同的提取条件下所获得的多糖组分的分子量、化学成分及结构稳定性不同,因此4种组分对巨噬细胞免疫活性的影响存在差异。

3 结 论

本实验通过顺序提取法,从中药三棱粉末中提取出4种多糖组分RSB、RSC、RSDA、RSCA，并对其理化性质及活性进行研究。理化性质结果表明，4种多糖组分均由阿拉伯糖、鼠李糖、甘露糖、木糖以及葡萄糖组成，其中葡萄糖为多糖RSB、RSC、RSCA的主要成分，摩尔分数分别为84.85%、78.89%、86.51%。RSB、RSC比碱提组分(RSDA和RSCA)的结构更稳定且热稳定性更好。活性分析结果表明:4种多糖对DPPH自由基、羟基自由基以及ABTS自由基有清除作用，其中RSB的抗氧化活性最显著，最高自由基清除率依次为81.47%、80.80%、52.57%；同时多糖RSB、RSC、RSDA、RSCA均能有效促进巨噬细胞的免疫活性，多糖的化学成分及热特性差异可能对活性有影响。研究结果有助于认识三棱多糖更深层次研究价值，为中药三棱精深利用提供参考。