苑华飞, 魏海燕, 曹江宇, 张蒙艺, 张 蕤, 徐红梅

(合肥工业大学 食品与生物工程学院,安徽 合肥 230601)

离子液体(ionic liquids,ILs)是一种熔点低于100 ℃,完全由阴、阳离子组成的有机盐[1-2]。相比于传统有机溶剂,ILs具有制备方法简单、溶解力强、热稳定性较高、不易挥发等优点,因而在化学合成[3]、萃取分离[4]和功能材料制备[5]等方面有着广泛的应用,被认为是挥发性有机溶剂的绿色替代品。然而越来越多的研究表明,ILs并非完全绿色环保[6],其对多种生物体(如细菌、细胞、蚯蚓、斑马鱼和水稻幼苗[7-11]等)都有一定的毒性。

随着ILs合成与应用的快速发展,部分ILs泄漏到环境中是不可避免的;同时,由于ILs性质稳定,易在环境或生物体内累积而产生危害。因此,研究ILs 对生物体的毒性及作用机制,评价其对生态环境的影响,具有深远的社会意义和重要的经济价值。

咪唑型ILs是近年来研究最为广泛的一类ILs[12],对其毒性评价的报道也逐渐增多,但有关咪唑型ILs对哺乳动物毒性的研究并不多。因此,本实验拟采用经济合作与发展组织(Organization for Economic Co-operation and Development,OECD)的“up-and-down procedure” (UDP)[13],考察咪唑型ILs四氟硼酸化1-十四烷基-3-甲基咪唑盐([C14mim]BF4)对大鼠的急性毒性,并通过HE染色法观察其对大鼠胃、肠、肝、肾等脏器组织的损伤,以期为咪唑型ILs毒性作用机理的探究提供实验参考依据。

1 材料与方法

1.1 离子液体

咪唑型ILs [C14mim]BF4由中国科学院兰州化学物理研究所合成,其纯度≥99%。

1.2 实验动物

健康SD大鼠10 只(6周龄),雄性,体质量约为(180±20) g,由安徽医科大学动物养殖中心提供,生产许可证为SCXK(皖)2018-001。大鼠饲养于标准动物房内(温度20～22 ℃、湿度65%～75%),自然光照,动物自由饮水、饮食。

1.3 试剂

生理盐水(0.9%氯化钠注射液)购自安徽丰原药业有限公司,批号为20190524;甲醛溶液(37.0%～40.0%)购自上海振企化学试剂有限公司,批号为20190112;无水乙醇购自上海中试化工总公司,批号为20190210。

1.4 实验仪器

JA2004N电子天平(上海精密科学仪器有限公司);RM2245Leica切片机(德国莱卡公司);IX71显微镜(OLYMPUS公司);微量移液器(北京东南仪诚实验室设备有限公司)。

1.5 实验方法

1.5.1 ILs溶液的配制

实验前,分别精密称取550、1 750、5 500、20 000 mg的[C14mim]BF4,各自溶于100 mL蒸馏水中,依次得到质量浓度为5.5、17.5、55.0、200.0 mg/mL的[C14mim]BF4溶液。

1.5.2 动物分组及染毒

根据UPD法,采用剂量序列55、175、550、2 000 mg/kg依次对大鼠进行经口染毒(每100 g体质量用1 mL药液)。[C14mim]BF4以175 mg/kg为起始剂量,先用1只大鼠进行染毒,观察48 h。若大鼠濒死或死亡,则降低剂量至55 mg/kg;若大鼠未出现死亡,则剂量递增至550 mg/kg;以此类推。染毒后存活的大鼠连续观察14 d,将每次染毒剂量、大鼠存活(记为○)和死亡(记为×)的结果输入AOT425StatPgm软件,计算出[C14mim]BF4的LD50值和95%可信区间。

1.5.3 中毒体征

大鼠染毒后逐日观察、记录其中毒反应,包括外观特征、行为活动、饮食与精神状况、是否死亡、中毒反应的严重程度、持续时间、是否可逆等,连续观察14 d。

1.5.4 组织病理学

不同染毒剂量大鼠死亡后立即解剖,分别观察各脏器的体积、颜色、质地等有无异常,并取其胃、小肠、心脏、肺、肾脏和肝脏,用10%甲醛溶液固定,不同梯度乙醇溶液逐级脱水,石蜡包埋,切片,HE染色,在OLYMPUS显微镜下,观察各组织的形态学变化。

2 结果与分析

2.1 中毒体征结果分析

观察期间,染毒大鼠出现毛色发黄、摄食减少、反应迟钝等中毒反应,随着染毒剂量增大,大鼠毒性反应增强。550 mg/kg剂量染毒大鼠出现毛发竖立、身体颤抖、呼吸急促、亢奋甚至无法站立等中毒症状;2 000 mg/kg剂量染毒大鼠的毒性反应最为强烈,表现为呼吸喘促、行走不稳、腹部胀大、全身抽搐等症状,并在24 h内死亡。

统计染毒大鼠的存活/死亡情况,结果见表1所列。

表1 [C14mim]BF4急性毒性试验大鼠存活和死亡结果

对中毒死亡的大鼠进行解剖,其肝脏、胃如图1所示。

从图1可以看出,染毒大鼠的肝脏组织呈暗红色,表面粗糙(图1b),局部出现淤血(图1c);2 000 mg/kg剂量染毒大鼠还出现胃、小肠胀气等现象(图1e)。

图1 染毒大鼠肝脏、胃图片

2.2 [C14mim]BF4的LD50

将急性毒性实验结果输入AOT425StatPam-程序,计算出[C14mim]BF4对大鼠的LD50值为249.8 mg/kg,其95%可信区间为175～550 mg/kg。

2.3 组织病理学结果分析

2.3.1 [C14mim]BF4对大鼠胃、小肠的损伤

HE染色后大鼠胃、小肠组织病理切片镜检(放大100倍)结果如图2、图3所示。

图2 大鼠胃组织病理切片

图3 大鼠小肠组织病理切片

由图2可知,正常大鼠胃粘膜细胞形态均匀,粘膜腺体排列规则,结构完整(图2a),随着染毒剂量的增加,大鼠的胃组织依次出现上皮细胞坏死(图2b)、脱落(图2c),甚至腺体结构遭到严重破坏(图2d)等损伤。由图3可知,小肠绒毛排列整齐、完整无损(图3a),小肠组织依次出现炎细胞浸润(图3b、图3c),绒毛层排列不规则,细胞坏死、脱落(图3d)。

2.3.2 [C14mim]BF4对大鼠心脏、肺的损伤

HE染色大鼠心脏、肺组织病理切片镜检(放大100倍)结果如图4、图5所示。由图4可知,正常大鼠的心肌细胞排列均匀整齐(图4a),[C14mim]BF4染毒后,大鼠的心肌组织依次出现细胞轻度淤血(图4b、图4c),横纹肌间隙增宽(图4c),肌束排列紊乱、断裂(图4d)等损伤。由图5可知,肺组织结构完整,肺泡上皮细胞形态均匀(图5a),肺组织依次出现间质出血、炎细胞浸润(图5b),肺泡间隔扩大、断裂(图5c、图5d)、间质弥漫性出血(图5d)等损伤,且其损伤程度随着[C14mim]BF4染毒剂量的增大而增强。

图4 大鼠心脏组织病理切片

图5 大鼠肺组织病理切片

2.3.3 [C14mim]BF4对大鼠肾脏、肝脏的损伤

HE染色后大鼠肾脏、肝脏组织病理切片镜检(放大100倍)结果如图6、图7所示。由图6可知,正常大鼠的肾小球、肾小管形态正常、染色均匀(图6a),染毒后大鼠的肾脏随着染毒剂量的增加,依次出现肾小管排列不规则(图6b),上皮细胞水肿(图6c)、脱落(图6d),肾间质、肾小球严重淤血(图6d)等变化。由图7可知,肝细胞以中央静脉为轴心呈放射状排列,细胞索结构清晰(图7a),肝细胞则出现点状坏死(图7b)、脂肪变性或空泡(图7c)、严重淤血(图7d)、胞质稀疏呈纤维网状(图7d)等一系列变化。大鼠肝细胞受损程度随着[C14mim]BF4染毒剂量的增大而增强。

图6 大鼠肾脏组织病理切片

图7 大鼠肝脏组织病理切片

3 讨 论

大量的研究资料表明,咪唑型ILs的毒性强弱与其烷基侧链的长度有关,本课题组前期的研究工作也证实:当咪唑型ILs 侧链取代基为C10、C12、C14时,随着碳链的增长,其对小鼠的毒性增强,当碳链长度为14时,毒性最强[14-15]。

本实验发现,[C14mim]BF4经口染毒可引起部分大鼠死亡,说明其对大鼠具有一定的毒性。根据测得的LD50值,参照《全球化学品统一分类和标签制度(GHS)》中急性毒性分类标准[16],可以判断[C14mim]BF4对大鼠经口染毒的毒性为中等毒性,这一结果与文献报道相一致[17-18]。

外源性的ILs经口进入大鼠体内后,首先经胃肠道消化吸收,然后随血液运输到心、肺、肝、肾等组织器官[19]。在实验中,本文考察了[C14mim]BF4对大鼠心、肺、肝、肾和消化系统的影响。病理结果表明:与正常大鼠相比,染毒组大鼠的胃、小肠、心、肺、肾和肝组织都受到了一定程度的损伤,且受损程度随着染毒剂量的增加而加重,但肝脏的损伤最为严重,在较低剂量时,[C14mim]BF4即可引起肝细胞脂肪变性或坏死。究其原因,可能与肝脏是外源性化合物或毒物在体内代谢与解毒的主要场所有关[20]。由此可见,肝脏是咪唑型ILs毒性作用的主要靶器官[21],心、肺、肾也有可能是ILs攻击的靶器官。

文献资料表明,咪唑型ILs的毒性虽然主要取决于阳离子类型,但阴离子对其毒性也有一定的影响[22-23]。文献[24]发现,ILs ([C4mim]Br、 [C4mim]Cl、[C4mim]BF4)对斜纹夜蛾9(Sf-9)细胞系的细胞毒性与阴离子有关,BF4-由于在高浓度下可被水解成HF,更容易进入细胞,因此比Br-和Cl-更具细胞毒性;文献[25]发现[Omim]BF4染毒可引起蚯蚓机体内细胞膜通透性增加,从而导致细胞内代谢紊乱与活性氧(ROS)过量积累,造成氧化损伤;文献[26]报道在急性暴露下,[Bmim]BF4会诱导斑马鱼体内ROS过度产生,引起脂质过氧化,导致肝脏损伤。

以上表明,肝脏在抵御咪唑型ILs毒性损伤中发挥了重要的作用[27]。[C14mim]BF4对大鼠肝脏急性损伤的机理以及BF4-在其中所起的作用将在今后的工作中进一步深入研究。

4 结 论

本文研究发现[C14mim]BF4对大鼠的LD50值为249.8 mg/kg,属于中等毒性。病理学结果显示,肝脏是 [C14mim]BF4对大鼠毒性作用的主要靶器官。