李广祯，马志杰*，赵学军，陈生梅，刘书杰，林 元，李文浩

(1.青海大学畜牧兽医科学院，青海省高原家畜遗传资源保护与创新利用重点实验室，青海西宁 810016；2.青海省同德县农牧和水利局，青海同德 813200)

牦牛是生活在以青藏高原为中心及其毗邻高山、亚高山高寒地区的特有珍稀牛种，其能在气候寒冷、空气稀薄和牧草生长期短的高寒生态环境中自如地生长繁殖，并为牧民提供肉、奶、皮等生活生产必需品[1]。同德县隶属于青海省海南藏族自治州，地处海南、黄南和果洛3个青海藏族自治州的交接处，是一个以牧为主，农牧结合的少数民族地区，位于三江源自然保护区青海省东南部九曲黄河第二曲，气候为典型的高原大陆性气候，县内平均海拔3 660 m。畜牧业是该县的主要产业之一，全县拥有天然草场面积约4,489,000 hm2，可利用草场面积约4,308,100 hm2。牦牛和藏绵羊是同德县的优势种畜和宝贵动物遗传资源，当前，其牦牛存栏量达15.6万头，藏绵羊68万只[2]。线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)D-loop区具有母系遗传、结构简单和进化速度快等特点，已被广泛应用于猪、羊、牛等家畜的母系遗传多样性、群体遗传结构和进化历史等研究[3-7]。先前基于D-loop序列已对我国多个省(区)牦牛品种(群体)的遗传多样性、分化和分类等问题进行了研究[8]。在青海牦牛的母系遗传研究中，郭松长等[9]对包括青海省环湖、高原和大通牦牛在内的10个我国家牦牛品种(群体)的D-loop区作了测序分析，表明我国家牦牛拥有丰富的遗传多样性，青海牦牛单倍型多样度最高，其中环湖、高原和大通牦牛的单倍型多样度分别为0.985±0.040、0.909±0.019和0.942±0.030，推测青海省可能为家牦牛的驯化中心。Wang等[10]对包括180头青海牦牛在内的共计405头我国家牦牛与47头野牦牛D-loop区进行综合分析，其中在青海牦牛中共检测到55种单倍型，包括特有单倍型33种，主要分布于A、B、C、D和E 5种单倍型组中，单倍型多样度为0.892±0.017。王兴东等[11]对155头青海高原牦牛Cytb基因和D-loop区全序列进行分析，表明高原牦牛单倍型多样度和核苷酸多样度分别为0.881和0.012，研究支持家牦牛和野牦牛划为牛亚科牦牛属的观点。侯孟典等[12]通过64头玉树牦牛与4个西藏牦牛品种(群体)(即类乌齐、申扎、帕里和斯布牦牛)D-loop区遗传多样性比较分析，表明玉树牦牛单倍型多样度最低(0.885±0.034)，而申扎牦牛单倍型多样度最高(0.956)；玉树牦牛与类乌齐牦牛、帕里牦牛的遗传距离最近，与斯布牦牛和申扎牦牛的遗传距离相对较远，5个牦牛类群聚类可分为2个分支。Yue等[13]对大通、环湖和高原牦牛以及其他10个家、野牦牛品种(群体)共742条D-loop序列进行综合分析，表明在家牦牛中大通牦牛单倍型多样度最高(0.945±0.025)，高原牦牛单倍型多样度较高(0.914±0.015)，而环湖牦牛单倍型多样度最低(0.785±0.048)。李瑞哲等[14]基于D-loop区序列变异对33头雪多牦牛母系遗传多样性及遗传背景进行分析，表明雪多牦牛单倍型多样度为0.900±0.043，具有2个母系起源。李广祯等[15]对34头曲麻莱牦牛D-loop区部分序列进行测定分析，表明其单倍型多样度为0.952±0.021，由2个母系支系组成。综上所述，除对其他我国省(区)牦牛品种(群体)的母系遗传研究外[8]，当前研究者已对青海省内部分牦牛品种(群体)如环湖、玉树、曲麻莱、高原、雪多和大通牦牛品种(群体)进行了母系遗传多样性、群体结构组成及遗传背景等分析[9,11-15]。然而，目前尚未见对青海省同德县牦牛群体的母系遗传多样性、群体遗传结构及系统发育分析的研究报道。鉴于此，本研究基于mtDNA D-loop区遗传变异对同德牦牛群体进行母系遗传多样性、群体遗传结构及系统发育探析，以便明确其遗传多样性水平、群体结构组成及遗传背景，为后续同德牦牛遗传资源的合理保护与开发利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 样品采集与基因组DNA提取

采用颈静脉采血法，在青海省同德县秀麻乡和河北乡共采集60头(32♂，28♀)牦牛颈静脉血样，使用血液基因组DNA提取试剂盒(艾德莱生物科技有限公司，北京)提取基因组DNA，低温保存备用。

1.2 引物设计合成和PCR扩增

使用Ma等[16]在野牦牛研究中运用的引物扩增同德牦牛mtDNA D-loop区序列，其上游引物(PF)为5'-CTACAGTCTCACCGTCAACC-3'，下游引物(PR)为5'-GGGGTGTAGATGCTTGC-3'，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

PCR反应体系为：2× Prime STAR Max Premix (上海宝生物公司) 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，基因组DNA为1 μL，超纯水9.5 μL，共计25 μL。其中PCR反应程序为：95 ℃预变性4 min；95 ℃变性1 min，62 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；后72 ℃延伸10 min。后对PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，后送至北京擎科生物有限公司进行测序。

1.3 数据处理与分析

将测序数据使用Chromas 2.3软件进行人工核对，确保数据的准确性，再用BioEdit 7.2.5软件进行多序列比对(ClustalW Multiple alignment)分析，后采用DnaSP 5.10.01软件确定同德牦牛的多态位点和单倍型数目，并使用Arlequin 3.11软件计算同德牦牛群体的单倍型多样度(Hd)和核苷酸多样度(Pi)大小，后用Network 10.1软件基于单倍型间的核苷酸变异绘制网络中介图(Median-Joining, MJ)以揭示单倍型(组)间的系统发育关系。

2 结果与分析

2.1 同德牦牛mtDNA D-loop区序列变异分析

通过测定60头同德牦牛的D-loop区序列，所测序列长度在890-894 bp之间，排除12处插入/缺失后共检测到59处多态位点，占所分析序列长度的6.63 %。在59处多态位点中，有17处为单一多态位点，即123、164、230、255、311、650、709、758、777、797、808、814、816、818、851、868和872位点，占总序列长度的1.91%；其余42处为简约信息位点，分别为109、116、134、141、173、188、194、221、248、249、250、256、257、267、276、285、293、296、309、310、314、315、317、326、329、334、356、391、392、398、501、539、694、697、720、731、798、800、810、813、884和885位点，约占总序列长度的4.72 %(图1)。

2.2 同德牦牛的母系遗传多样性分析

对60头同德牦牛D-loop区序列进行分析，共确定了31种单倍型，其中单倍型H8由14个个体共享，为优势单倍型，单倍型H9和H10均由4个个体共享，H3和H29均由3个个体共享，单倍型H5、H15、H17、H19、H22和H28均由2个个体共享，其余的单倍型均由1个个体所拥有(图1)。计算后群体单倍型多样度为0.935±0.023，核苷酸多样度为0.012±0.006，序列平均核苷酸差异K值为7.48。

注：“.”代表与H1单倍型序列中的核苷酸相同；N代表分享同一种单倍型的个体数；Hg代表单倍型组类型。

将同德牦牛的遗传多样性指数值大小与已报道的6个其他青海省牦牛品种(群体)相应数值进行比较分析(表1)，结果表明：在青海省牦牛品种(群体)中，曲麻莱牦牛群体的单倍型多样度值(0.952)最高，环湖牦牛品种的单倍型多样度(0.785)值最低。相比而言，同德牦牛群体单倍型多样度值(0.935)也较高，表明其具有丰富的母系遗传多样性。

表1 同德牦牛与6个青海省其他牦牛品种(群体)母系遗传多样性指数值大小比较

2.3 同德牦牛的系统发育分析

从GenBank中下载美洲野牛(Bison bison)(GenBank No：EU177871)的D-loop序列作为外群，与同德牦牛31种D-loop序列单倍型构建网络关系图(图2)，结果显示：31种单倍型聚为2个支系，其中H3和H11单倍型为1支(即支系Ⅱ)，占总单倍型数的7%(2/31)；剩余的29种单倍型聚为另1支(即支系Ⅰ)，占总单倍型数的93%(29/31)。同德牦牛31种单倍型隶属于A、B、C、D和E 5种单倍型组，所占比例分别为58%(18/31)、26%(8/31)、3%(1/31)、3%(1/31)和10%(3/31)。

注：圆圈大小与拥有各单倍型的个体数目大小成正比。

3 讨论

遗传多样性是生态系统多样性和物种多样性的基础和核心，物种或居群的遗传多样性大小是长期进化的产物，是其生存适应和发展进化的前提。家畜遗传多样性是生物多样性的重要组成部分，与人类未来的生存与发展密切相关。家畜群体遗传变异的高低与遗传结构的差异是其遗传多样性的重要体现。先前对我国野牦牛母系遗传多样性的研究得出，野牦牛拥有2～3个母系遗传分支，且拥有丰富的遗传多样性，其单倍型多样度在0.920～1.000之间[10,13,16-17]。而我国家牦牛母系遗传多样性、分化与系统发育的分析表明：家牦牛品种(群体)间存在较为显著的遗传分化，无明显的谱系地理结构，遗传多样性丰富，其单倍型多样度在0.785～0.983之间，由2个母系遗传分支组成[8-15,17-18]。在青海省牦牛品种(群体)的母系遗传多样性研究中，已报道的高原、环湖、大通、玉树、雪多和曲麻莱牦牛品种(群体)的单倍型多样度在0.785～0.952之间，核苷酸多样度在0.020～0.016之间[9,11-15]。而在本研究中，同德牦牛群体的单倍型多样度为0.935±0.023，核苷酸多样度为0.012±0.006，其值与青海省其他6个牦牛品种(群体)母系遗传多样性指数值大小相比较高，表明同德牦牛群体拥有较高的母系遗传变异，具有丰富的母系遗传多样性。

在对同德牦牛的系统发育分析中，31种单倍型可以分为2个大的支系，说明同德牦牛具有2个母系起源，这与先前对家牦牛其他品种(群体)的母系遗传背景的研究结果一致[8-15,16-18]。在单倍型组网络关系分析中，同德牦牛单倍型分布在A、B、C、D和E单倍型组中，可以看出A单倍型组在同德牦牛中占主导地位，所占比例为58%，而C与D单倍型组所占比例较少，仅为6%，这与Yue等[13]和Guo等[17]对其他家牦牛品种(群体)的研究结果一致，说明同德牦牛具有与其他家牦牛品种(群体)相似的母系群体遗传结构组成。

4 结论

同德牦牛单倍型多样度为0.935±0.023，核苷酸多样度为0.012±0.006，具有丰富的母系遗传多样性，其中H8为优势单倍型，31种单倍型分布在A、B、C、D和E 5种单倍型组中，拥有2个母系支系，具有2个母系起源。