张丽静，付 劢，张文会，陈 锋，范 蓓，于翠翠，李淑英，卢 聪，张娜娜，王凤忠

(1 中国农业科学院 农产品加工研究所，北京 100193；2 西藏自治区农牧科学院农产品开发与食品科学研究所，西藏 拉萨 850000)

芜菁(BrassicarapaL.)为十字花科芸苔属植物，是西藏地区的传统食用蔬菜，因营养丰富而深受当地百姓喜爱，并且具有下气宽中、利湿解毒的功效[1-3]。芜菁中含有多种营养功能成分，如黄酮、多糖及挥发油等[4-5]，具有抗氧化、抗缺氧、调节血脂等作用[6-10]，芜菁膏(妞玛堪扎)是由芜菁干燥块茎加工制成的膏状饮品[11]，又名蔓菁膏，收录在藏医药经典著作《晶珠本草》中[12]。传统藏医药理论认为，蔓菁膏具有解毒滋补的功效，主治各种中毒症。现代药理研究表明，蔓菁膏具有抗高原缺氧、抗氧化、抗疲劳、抗辐射等作用[13-15]。

目前植物有机成分的提取方法主要有碱性稀醇或碱性水提取、超声提取、微波提取、超临界萃取、酶解提取等[16-18]。其中超声波提取法能够产生空化作用，从而有效破坏组织的细胞壁，促进活性成分释放，且对有效成分的破坏性小，与传统方法相比，该法提取效率高、提取时间短且节能环保，因此广泛应用于植物活性成分的提取[19-23]。响应面法通过建立连续变量模型，对各影响因素及交互作用进行优化及评价，分析结果更加直观和精确，因此广泛用于活性成分提取及食品加工过程中的工艺优化研究[24-25]。目前对芜菁膏制备工艺的研究较少，仅见王宇等[13]通过均匀设计法对芜菁膏制备工艺进行了优化，尚无通过响应面优化超声法制备芜菁膏工艺的研究。因此，本试验以出膏率为考察指标，通过单因素试验和Plackett-Burnman试验，筛选对出膏率影响显著的因素，并通过Box-Behnken响应面法优化芜菁膏制备的最佳工艺，同时探究其抗氧化活性，旨在为芜菁膏的高效制备和利用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

芜菁样品产自西藏昌都地区，由西藏自治区农牧科学院提供，经鉴定为十字花科芸苔属芜菁种芜菁的块茎。DPPH，美国Sigma公司；抗氧化能力检测试剂盒(ABTS+)，碧云天生物技术有限公司；乙醇等试剂(分析纯)，国药集团化学试剂公司；Raw 264.7细胞，国家实验细胞资源共享平台。

KQ-600V超声波清洗器，昆山舒美超声仪器有限公司；Spectra Max 190酶标仪，美国Molecular Device公司；IKA旋转蒸发仪，美国IKA公司；AL204分析天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；HH-1恒温水浴锅，北京市永光明医疗仪器有限公司；DHG-9203A鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司。

1.2 芜菁膏超声提取条件的单因素试验

针对超声提取芜菁膏的超声功率、超声时间、料(g)液(mL)比和提取次数4个影响因子，通过单因素试验分析其对出膏率的影响。

1.2.1 超声功率对出膏率的影响 将超声时间固定为60 min，料液比固定为1∶10，提取次数为2次，考察超声功率(400，500，600，700，800 W)对出膏率的影响。

1.2.2 超声时间对出膏率的影响 将料液比固定为1∶10，提取次数2次，超声功率600 W，考察超声时间(40，50，60，70，80 min)对出膏率的影响。

1.2.3 料液比对出膏率的影响 固定提取次数为2次，超声功率600 W，超声时间60 min，考察料液比(1∶6，1∶8，1∶10，1∶12，1∶14)对出膏率的影响。

1.2.4 提取次数对出膏率的影响 固定超声功率600 W，超声时间60 min，料液比1∶10，考察提取次数(1，2，3，4，5次)对出膏率的影响。

1.2.5 出膏率的测定 参考文献[13]中的方法，精密量取芜菁超声提取液25 mL，放于干燥至恒质量的蒸发皿中，在水浴上蒸干后于105 ℃条件下干燥3 h，随后移至干燥器中，冷却30 min后迅速精密称量浸膏的质量，计算出膏率。重复3次，结果取平均值。

出膏率=W1/W2×100%，其中，W1为浸膏的质量，W2为芜菁原料样品的质量。

1.3 芜菁膏超声提取条件的Plackett-Burman正交试验

在单因素试验基础上，通过Plackett-BurmanL12(24)试验设计对4个影响因素进行评估。以出膏率为响应值，对每个因素取高水平和低水平值，筛选影响显著的因子用于后续响应面试验，重复3次。Plackett-Burman 试验的因素及水平见表1。

表1 芜菁膏超声提取条件 Plackett-Burman L12(24)正交试验的因素及水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman L12(24) orthogonal experiment for ultrasonic extraction conditions of Brassica radix

1.4 芜菁膏超声提取条件的Box-Behnken响应面优化试验

在单因素试验及Plackett-Burman试验基础上，以超声功率、超声时间和料液比3个对出膏率影响显著的因素为自变量，以出膏率为响应值进行响应面优化试验，对提取工艺进行优化，确定最佳工艺条件。试验设计见表2。

表2 芜菁膏超声提取条件Box-Behnken响应面试验的因素及水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken response surface experiment for ultrasonic extraction conditions of Brassica radix

1.5 芜菁膏最佳提取工艺验证

基于响应面优化试验得到的最佳工艺条件，重复进行3次提取试验，计算出膏率的平均值。

1.6 芜菁膏的抗氧化活性研究

1.6.1 DPPH自由基清除试验 DPPH自由基清除试验参照何兰香等[26]的方法但稍作修改。取不同质量浓度(100,200,400,800,1 600 μg/mL)的芜菁膏水溶液，加入0.5 mg/mL的DPPH溶液，同时设水加DPPH溶液处理，摇匀后放置在避光处静置30 min，在515 nm处检测芜菁膏水溶液、芜菁膏水溶液加DPPH溶液、水加DPPH溶液的吸光值，根据吸光值计算DPPH自由基清除率，并计算芜菁膏对DPPH自由基的半数清除率(IC50)。试验重复3次，结果取平均值。

DPPH自由基清除率=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100%。

式中：Ai为芜菁膏水溶液加DPPH溶液的吸光值；Aj为芜菁膏水溶液的吸光值；Ac为水加DPPH溶液的吸光值。

1.6.2 ABTS+自由基清除试验 根据ABTS+检测试剂盒的操作步骤检测芜菁膏对ABTS+自由基的清除活性，芜菁膏水溶液质量浓度设置100,200,400,800,1 600 μg/mL，用量为10 μL。根据结果计算芜菁膏对ABTS+自由基的IC50。

1.6.3 MTT细胞增殖检测试验 参考文献[4]的方法进行试验。取处于对数生长期的Raw 264.7细胞，接种于96孔培养板，培养24 h后，弃掉培养基；分别加入不同质量浓度(0(模型组)，400，800，1 600 μg/mL)的芜菁膏，继续培养6 h；加入400 μmol/L H2O2，培养12 h，加入MTT孵育4 h后，弃掉培养基，加入200 μL的DMSO，用酶标仪检测吸光值，检测波长为570 nm。试验同时设置正常培养的细胞为对照组(不加芜菁膏和H2O2)。计算细胞的存活率：细胞存活率 =1-(对照组吸光值-试验组吸光值)/对照组吸光值×100%。

1.7 数据处理

所有试验均重复3次，结果用“平均值±标准误差”表示。采用Graphpad prism 6对单因素及抗氧化试验结果进行处理，用Minitab 17对Plackett-Burman试验结果进行分析，采用Design Expert 8对响应面试验进行设计与分析。

2 结果与分析

2.1 单因素对芜菁膏出膏率的影响

2.1.1 超声功率 由图1可知，随着超声功率的提高，芜菁出膏率呈先增加后降低趋势，这是因为当超声功率过大时，提取剂流动加快，在物体表面停留时间减少，使得溶出度减小，出膏率也逐渐降低[27]。当超声功率达到600 W时，出膏率达到最大值，为57.1%，因此超声功率以600 W为宜。

2.1.2 超声时间 由图2可知，随着超声时间的延长，出膏率表现出先增加后趋于平稳的趋势。当超声时间达到60 min时，出膏率达到最大值，为55.9%；随着超声时间的继续增加，出膏率基本不变。考虑到继续增加超声时间会提高经济成本，出膏率却基本保持不变，而提取物中的功能因子的稳定性反而有所降低[28]，因此选择超声时间为60 min。

图1 超声功率对芜菁膏出膏率的影响Fig.1 Effect of ultrasonic power on yield rate ofBrassica radix

2.1.3 料液比 由图3可知，出膏率随料液比的增加呈先增加后趋于平稳的趋势。当料液比为1∶10时出膏率达到最大，为56.1%；继续增加料液比，出膏率保持稳定[28]。因此，考虑到提取效果及成本，选择料液比为1∶10。

图3 料(g)液(mL)比对芜菁膏出膏率的影响Fig.3 Effect of material to liquid ratio on yield rate ofBrassica radix

2.1.4 提取次数 由图4可知，随着提取次数的增加，芜菁膏出膏率逐渐增加，提取次数为2次时出膏率达到最大(53.8%)，继续增加提取次数，出膏率略有增大，但总体保持平稳。因此将提取次数确定为2次。

2.2 芜菁膏出膏率影响因素的Plackett-Burman正交试验结果

Plackett-Burman试验结果如表3所示，通过Minitab软件进行回归分析和显著性检验，结果见表4。表4表明，因素A(超声功率)、B(超声时间)、C(料液比)对芜菁膏出膏率影响显著，因此选择这3个因素进行后续的响应面优化试验。提取次数对出膏率的影响不显著，因此将后续试验的提取次数设定为2次。

表3 芜菁膏超声提取条件 Plackett-Burman L12(24)正交试验结果Table 3 Levels of various factors and response results of Plackett-Burman L12(24) for ultrasonic extraction conditions of Brassica radix

表4 芜菁膏超声提取条件Plackett-Burman L12(24)正交试验结果的显著性检验Table 4 Significance test of factors of Plackett-Burman L12(24) for ultrasonic extraction conditions of Brassica radix

2.3 芜菁膏制备工艺的Box-Behnken响应面优化

Box-Behnken响应面优化试验方案及结果见表5。根据表5结果，利用Design Expert 软件对出膏率与A(超声功率)、B(超声时间)、C(料液比)进行二次多元回归拟合，得到出膏率的回归方程为：

式中：x1、x2、x3分别代表A、B、C因素。

表5 芜菁膏超声提取条件Box-Behnken响应面试验设计与结果Table 5 Design and results of Box-Behnken response surface analysis for ultrasonic extraction conditions of Brassica radix

回归方程的方差分析结果如表6所示。由表6可知，影响芜菁膏出膏率的3个因素依次为：超声功率(A)、超声时间(B)、料液比(C)，可以看出，超声功率(A)对出膏率的影响极显著(P<0.01)、超声时间(B)对出膏率的影响显著(P<0.05)。根据回归模型预测芜菁膏制备的最佳工艺为：超声功率614 W、超声时间62.74 min、料液比1∶9.45，提取次数根据单因素试验结果设定为2次，在此条件下出膏率为59.47%。

表6 芜菁膏超声提取出膏率对超声功率(A)、超声时间(B)、料液比(C)回归方程的方差分析结果Table 6 Analysis of variance for regression equations of extraction rate of Brassica radix to ultrasonic power (A),ultrasonic time (B),and material-liquid ratio (C)

2.4 芜菁膏提取工艺的验证

根据预测值，在实际操作中将提取条件设定为：超声功率614 W，提取时间63 min，料液比1∶9.5，重复提取3次,在此条件下芜菁膏出膏率的平均值为59.02%，与预测值仅相差0.76%，在试验允许的误差范围内，因此该条件可用于芜菁膏的制备。本试验出膏率与王宇等[13]通过均匀设计法优化芜菁膏提取工艺得到的结果(51.93%)相比，有明显的提高。

2.5 芜菁膏的抗氧化活性

2.5.1 对DPPH自由基清除能力 DPPH自由基在515 nm处有最大吸收峰，其乙醇溶液呈深紫色，当存在有自由基清除能力的抗氧化剂时，抗氧化剂可与DPPH自由基的单电子配对，继而使其吸收逐渐消失，且其褪色程度与接受的电子数成定量关系，因而可用比色法进行定量分析，以检测自由基的清除情况，从而评价样品的抗氧化能力[29]。由图5可知，随着质量浓度的增加，芜菁膏对DPPH自由基的清除能力逐渐增强，表明芜菁膏与DPPH自由基清除率之间存在量效关系。根据试验结果，计算出芜菁膏清除DPPH自由基的IC50为277.54 μg/mL，表明芜菁膏能够有效清除DPPH自由基。

*，**分别表示与100 μg /mL组相比差异显著和极显著。图6同 * and ** mean significant and extremely significant difference compared with the 100 μg/mL group,respectively.The same below图5 芜菁膏的DPPH自由基清除活性Fig.5 DPPH free radical scavenging capacity ofBrassica radix

2.5.2 对ABTS+自由基清除能力 ABTS+自由基清除能力常用于评价各种混合物或均一物质的总抗氧化能力，样品在波长734 nm 处的吸光值可反映其抗氧化活性[30]。由图6可见，随着质量浓度的增加，芜菁膏对ABTS+自由基的清除率逐渐增大，表明芜菁膏与ABTS+自由基清除率之间存在着量效关系。经计算，芜菁膏清除ABTS+自由基的IC50为381.26 μg/mL，表明芜菁膏能够有效清除ABTS+自由基。

图6 芜菁膏的ABTS+自由基清除能力Fig.6 ABTS+ free radical scavenging capacity of Brassica radix

2.5.3 对氧化应激损伤细胞增殖的促进作用 细胞存活率是反映外界环境对细胞损伤程度的最直观指标。氧化应激损伤会导致胞内活性氧水平升高，进一步诱导细胞凋亡，表现为细胞存活率降低。H2O2常用做体外氧化应激损伤的造模药物，其中超氧阴离子自由基能使细胞膜上的脂质物质和蛋白发生氧化反应[31]。芜菁膏对H2O2诱导Raw 264.7细胞存活率的影响如图7所示。

a表示与对照组(不加芜菁膏和H2O2)相比差异显著(P<0.05)；*表示与模型组(0 μg/mL)相比差异显著(P<0.05)a means significant difference (P<0.05)compared with the control group(0 μg /mL Brassica radix and H2O2)；* means significant difference(P<0.05)compared with the model group(0 μg/mL)图7 芜菁膏对H2O2诱导Raw 264.7细胞存活率的影响Fig.7 Effect of Brassica radix extract on viability of Raw 264.7 cells induced by H2O2

由图7可见，与对照组(CK)细胞相比，模型组(0 μmol/L)细胞存活率显著下降。与模型组相比，不同质量浓度的芜菁膏均能有效提高受损细胞的存活率，其中高质量浓度(1 600 μg/mL)的芜菁膏能够显著提高细胞的存活率至82.57%。结果表明，芜菁膏对H2O2诱导的Raw 264.7细胞氧化应激损伤具有保护作用。

3 结 论

本研究将超声辅助法应用于芜菁膏的制备中，通过单因素试验和Plackett-Burman正交试验，确定芜菁膏制备过程中各个因素对提取率的影响力大小依次为超声功率>超声时间>料液比。利用Box-Behnken响应面法进行分析，得到的最优制备工艺为：超声功率614 W，提取时间63 min，料液比1∶9.5，对应的出膏率为59.02%。与其他制备方法相比，超声辅助法提取率高，制备时间短。对芜菁膏抗氧化活性的研究表明，芜菁膏具有一定的抗氧化活性，对DPPH和ABTS+自由基的IC50分别为277.54和381.26 μg/mL；可改善H2O2诱导的Raw 264.7细胞氧化应激损伤，提高细胞的存活率至82.57%。