王 贺，赵玉红,2,*，杨 凯

（1.东北林业大学林学院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江省森林食品资源利用重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150040；3.黑龙江省林业科学研究院，黑龙江 哈尔滨 150081）

红松（Pinus koraiensis）是松科常绿乔木，主要分布在中国东北、俄罗斯东南部、朝鲜半岛和日本[1]，红松籽是红松的果实，也是我国农业重要的产品之一[2]，松籽油是以红松籽为原料得到的油脂，松籽油作为天然无环境污染的绿色木本植物油脂，具有预防糖尿病[3]、心脑血管疾病[4]、降低胆固醇[5]、防癌等功能[6]，是世界公认的优质植物油，松籽油不饱和脂肪酸含量高达80%以上，并含有丰富的功能活性成分，如角鲨烯、芝麻素、谷甾醇和虾青素等甾醇类物质[7-8]。除了营养成分外，其细腻独特的风味深受消费者喜爱，大多作为调味品使用，松籽油特有的风味与挥发性化合物密切相关[9]。

挥发性成分是确定油脂品质的重要属性，对消费者的接受程度起关键作用[10]。挥发性成分主要包括醇类、醛类、酸类、呋喃类、吡嗪类、噻唑类、吡咯类等[11-12]，受品种、生长阶段、气候、贮存和加工方法等因素的影响[13-14]，这些因素决定挥发性成分的定量和定性组成，而品种多样性是影响挥发性成分的重要因素[15]。目前不同品系（种）松籽油的研究主要集中在理化性质、营养成分、功能分析等方面[16-18]，有关不同品系红松籽油挥发性成分差异的研究鲜见报道。

顶空固相微萃取与气相色谱-质谱（headspace solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）联用技术广泛用于挥发性成分的定性和定量分析，该技术具有操作简单、节约时间、准确性和安全性高等优点，但该方法价格昂贵且不能用于检测挥发性气味的成分[19]，而电子鼻（electronic nose，E-nose）技术可以模仿人类的嗅觉功能以识别气味，可以准确区分不同的样本气味[20]，能够快速、准确地提供气味检测结果，但运用E-nose技术不能对挥发性成分进行定性、定量分析[21]。因此，本实验结合2 种对风味进行分析，可以起到良好的验证和相互补充的作用，能更好地区分油脂的风味化合物的特征差异[22]。HS-SPME-GC-MS与E-nose相结合的方法已应用于不同品种橄榄油的分类[23]，识别不同氧化期间风味化合物的薏仁油[24]，但这些研究并未分析这2 种技术之间的相关性，且这2 种技术对不同品系松籽油挥发性物质相关性分析的研究也较少。

本实验采用HS-SPME-GC-MS结E-nose技术，通过主成分分析（principal component analysis，PCA）和线性判别分析（linear discriminant analysis，LDA）等方法对10 个东北优良品系红松籽油的挥发性风味成分进行分析和评价，旨在为松籽油生产加工过程的品质评价与控制提供参考，为建立松籽油特征信息数据库和松籽油风味遗传改良的育种工作提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

25 个品系（品种）中选取10 个优良品系的红松松籽由黑龙江省林业局下属林业科学研究院提供，编号为S-31、S-34、S-49、S-72、S-123、S-124、S-125、S-130、S-154、S-185，以上样品依次简称为样品1、2、3、4、5、6、7、8、9、10；于-20 ℃贮藏。

1.2 仪器与设备

7890B-5977A GC-MS谱联用仪 美国安捷伦公司；固相微萃取器手柄、30/50 μm DVB/CAR/PDMS萃取头美国Supelco公司；sniffer 9000嗅闻装置 瑞士Brechbuhler公司；PEN3 E-nose传感器 上海瑞玢国际贸易有限公司。

1.3 方法

1.3.1 松籽油样品的制备

将松籽去壳后得到的松仁磨成粉末，根据Kemerli-Kalbaran等[25]的研究方法制备松籽油。取5 g松仁粉末，置于11 倍体积的正己烷中，浸提35 min后抽滤，得到抽滤后的溶液，45 ℃旋转蒸发回收正己烷，得到松仁油，4 ℃冷藏待用。

1.3.2 样品顶空前处理条件

取5 mL松籽油放入样品瓶中，60 ℃水浴中平衡10 min，将老化好（预先插入约200 ℃气相检测口处加热约5 min）的萃取针头插入样品瓶中，将石英纤维头暴露于样品瓶的顶空气体中，恒温60 ℃萃取45 min，用手柄将纤维头推回针头内拔出，插入GC-MS的进样器于250 ℃解吸1 min，同时启动仪器采集数据。

1.3.3 GC条件

进样口温度250 ℃，载气He，流速1.0 mL/min。采用程序升温方式，40 ℃保持2 min，然后以6 ℃/min升至230 ℃，保持13 min，不分流进样。

1.3.4 MS条件

MS离子源225 ℃全扫描，电离方式为电子电离源（electron impact，EI），电子能量70 eV；扫描质量范围m/z50～500。

1.3.5 E-nose传感器检测

取10 mL松籽油于15 mL顶空瓶中，用聚四氟乙烯隔垫密封，放在E-nose仪器的托盘上按设置的条件待测。E-nose条件：顶空产生温度60 ℃，顶空产生时间600 s、载气流速400 mL/min、进样体积5.0 mL、进样速率2.5 mL/s。传感器信号分析：E-nose共有10 个传感器，检测每个样品时共采集90 s。E-nose编号及其对应敏感物质信息见表1。

表1 PEN3 E-nose传感器敏感物质Table 1 PEN3 E-nose sensors sensitive to various volatile substances

1.4 数据处理

对GC-MS总离子流图的各峰经MS计算机数据系统检索及核对Nist 2.2谱库，仅保留匹配度大于800（最大值1 000）的鉴定结果，用峰面积归一化法计算各挥发性成分的相对含量。E-nose根据传感器采集的原始数据进行统计学分析，检测结果由仪器自带的Win Muster软件进行PCA和LDA。单因素试验每次做3 个平行样，采用SPSS 19.0软件处理数据，并采用单因素方差分析比较均值，P＜0.05，差异显著。

2 结果与分析

2.1 挥发性成分分析

挥发性成分是决定消费者对食用植物油品质的接受和偏好程度的重要特征，且影响植物油整体风味[26]。为比较和评价不同品系红松籽油的挥发性成分，采用HS-SPME-GC-MS对10 种优良品系松籽油样品进行挥发性成分分析。

10 种松籽油通过HS-SPME-GC-MS分析，共鉴定163 种挥发性物质。其中包含7 种类型的挥发性物质：烃类（62 种）、醇类（19 种）、醛类（10 种）、酯类（24 种）、酮类（14 种）、酸类（19 种）、其他（10 种）。此发现与杨春英等[27]研究多种植物油挥发性风味成分的结果相似，说明植物油的香味不是由一种或几种化合物组成，而是由多种类型的化合物协同作用，体现不同的特征香味。烃类、醛类、醇类和酯类相对含量明显高于其他类型的挥发性物质，这4 类物质是松籽油中主要挥发性物质，约占总挥发性成分的72.59%，而且这些化合物种类大多数存在差异，样品1、5、6、7、9均高于平均值，其中样品5（80.05%）最高，为80.05%，样品8（60.73%）。

烃类物质共有62 种，饱和烃类物质在总挥发性物质中占比虽然很大，但烃类整体阈值较高，所以风味贡献不大。烃类相对含量占12.26%～20.07%，2-甲基-戊烷与3-甲基-戊烷在10 种松籽油中均存在，且每个品系中3-甲基-戊烷含量均高于2-甲基-戊烷。(-)-β-蒎烯、柠檬烯、莰烯在红松松针[28]和松壳[29]的挥发油和杜松籽油[30]的风味物质研究中也均有发现。

醛类是植物油中重要的挥发性成分，多数醛类一般产生较好的风味，主要有油脂味、坚果味和青草味，但醛类也可能具有毒性，如(E,E)-2,4-癸二烯醛被认为是致癌物质或可疑致癌物[31]。醛类物质相对含量占12.99%～20.20%，除样品4、8、10外，(E,E)-2,4-癸二烯醛在其余7 个样品中均检测到，其中样品5相对含量最高，约占醛类的50%，其次为样品3、6。但在样品4、8、10中检测到3-甲基-2-丁醛相对含量较高，分别为4.75%、4.02%、4.55%。杨春英等[27]对葵花籽油、玉米油等多种食用油的挥发性成分研究发现，同种食用油（除橄榄油[32]）可同时检测到辛醛和壬醛，但本研究中10 种松籽油均未同时检测到。丙醛、5-乙基环戊-1-烯甲醛在松籽油中含量较少，仅在个别品种可检测到。

醇类挥发性物质源于油脂中不饱和脂肪酸的生物降解，而且醇类物质是生成酯类物质的主要前体物质。主要通过脂肪酶作用、羰基化合物还原合成醇类物质，其气味柔和、有植物香味，其气味阈值较高，仅能贡献微弱的清香味[10]。10 个样品中醇类物质相对含量占12.26%～24.07%，除样品8外，醇类物质均以环己醇、2-环己烯-1-醇、3-己烯-1-醇和2-己烯-1-醇为主，其均贡献出药草香味。样品8的醇类物质主要以1-十二烯-3-醇、环戊醇为主，且其相对含量最低，此差异的原因可能为红松籽的品种不同。

样品中酸类物质相对含量较少，仅含0.43%～9.19%，其中主要是乙酸和壬酸。乙酸主要通过脂氧合酶路径的酶解反应产生，其具有油脂腥味，可能对松籽油青腥味有一定影响，且乙酸可以通过酯的形式与糖结合[33]，促进风味的形成。酯类物质主要通过脂肪酸分解产生，不同食用油酯类差异较大，大多数的酯类化合物均有甜味。酯类物质占19.02%～25.81%，其中主要以乙酸乙酯为主，相对含量为5.39%～10.01%，其中样品6最低，样品4最高。酮类挥发性物质主要来源于多不饱和脂肪酸的热降解或β-氧化，其一般具有花香和果香[34]，其相对含量为7.38%～12.38%，样品7相对含量最低，样品8最高。

综上，10 种松籽油挥发性成分具有一定差异，主要贡献风味的物质为醛类、醇类和酯类，其主要为2,4-癸二烯醛、3-甲基-2-丁醛、辛醛、壬醛、环己醇、2-环己烯-1-醇、3-己烯-1-醇和2-己烯-1-醇、1-十二烯-3-醇、环戊醇和乙酸乙酯。这些物质阈值比较低，对风味贡献极大。而一些烯烃类物质虽然含量很少，但可对风味的形成产生一定的影响，此类物质与脂肪酸的烷氧基均裂有关，可提高油脂的整体风味。

如图1所示，10 种松籽油中烃类物质数量最多，约占总数量的30%。酯类物质次之，醛类与酮类物质数量基本持平。鉴定总挥发性风味物质个数的大小关系为：样品1＞样品3=样品6＞样品2=样品7=样品10＞样品8=样品9＞样品4＞样品5。6 种松籽油的总挥发性物质数量超过其平均值，分别为样品1、3、6、2、7和10，总挥发性物质个数依次为71、65、65、64、64和64 个。

图1 10 种松籽油的挥发性风味物质种类数Fig.1 Number of volatile compounds in 10 pine nut oils

由图2可知，烃类物质种类虽然最多，但其相对含量却不高，其中酯类和醇类相对含量高于其他种类。除样品7外，所有样品鉴定挥发性物质相对含量中的酯类高于其他类物质，其中，样品1、5、8和9鉴定酯类的相对含量较高，均值分别为24.90%、25.81%、23.22%和24.01%。样品7（19.02%）在所有品系的酯类物质相对含量最低。样品1、2、7、10中鉴定的醇类物质数量较多，分别为14、11、11、11 个，其中样品7（24.07%）中醇类的相对含量最高。所有品系中醛类物质数量仅次于其他类物质，但挥发性成分相对含量均值占总数的16.33%，相对含量均值高于酸类（13.75%）、醛类（9.66%）和其他类（3.92%）。样品3、4、6、7、9分别鉴定烃类物质27、22、22、22、24 种，高于其他品系中烃类物质的数量，其中样品7（20.07%）中烃类相对含量最高；样品6（19.01%）次之。因此，10 种松籽油中挥发性物质含量及其所属种类及其数量存在一定的差异性。

图2 10 种松籽油的挥发性风味物质相对含量Fig.2 Relative contents of volatile compounds in 10 pine nut oils

2.2 挥发性成分聚类分析和PCA

聚类分析是描述不同品种间差异的方法，反映挥发性特征相似的红松籽油在一定程度上的同质性，而不同的聚类则反映不同的相似性[35]。本研究采用以欧氏距离为度量的群间连锁法进行聚类分析，合并后数据以树状图形式呈现。

如图3所示，将含有相似特征成分的样品集合为一组，根据红松籽油的挥发性成分组成和含量，将10 个不同的样品明显分为3 类。样品2、3、4、8、10为第1类，此类的酸类、酮类成分含量高于另外两类；样品6、7为第2类，烃类含量较高；样品1、5、9为第5类，酯类、醛类含量较高。由图4可知，PCA提取2 个PC，累计贡献率为75.7%，可以较好地反映松籽油的挥发性成分。所有样品分离很好，根据所处象限位置将样品分成3 类的结果与聚类分析结果一致，样品2、3、4、8、10在PC1上呈负向分布，样品6、7在PC2上呈正向分布，样品1、5、9在PC1和PC2中均为正值，同一类样品挥发性成分含量及组成均具有相似性，说明品种是影响挥发性成分含量及其组成的决定因素。此结果对于选择加工品种以制备特定口味和香味的调味松籽油具有重要作用。

图3 10 种红松籽油挥发性成分聚类分析Fig.3 Dendrogram for clustering analysis of volatile components in 10 pine nut oils

图4 10 种红松籽油挥发性成分PCAFig.4 PCA plot of volatile components in 10 pine nut oils

2.3 E-nose分析10 种红松籽油挥发性成分

E-nose根据一系列的化学气体传感器，结合多元统计学方法获得样品中挥发性化合物的完整信息，但得不到定性、定量的结果[36]。根据10 种红松籽油在10 个传感器上的响应值得出松籽油雷达指纹图如图5所示。

图5 10 种红松籽油的气味雷达指纹图Fig.5 Odor radar fingerprints of 10 pine nut oils

图5可比较E-nose对不同品系松籽油响应值的差异，结合表1可知，R1、R3、R4、R5、R10传感器对样品的响应值较小，而R2、R6、R7、R8、R9传感器对不同品系松籽油的响应值最大，说明样品对氮氧化物、氢氧化合物、烷类、硫化物和芳香成分的灵敏度较理想。10 个样品在R2、R6、R7、R8、R9传感器的信号响应值有差异，表明这5 个传感器检测的挥发性成分组成相差较大，而10 个样品在其余5 个传感器的信号响应值几乎重叠，因此这5 个传感器检的挥发性成分组成基本相似。样品7的雷达响应图和其他种类松籽油具有差异，对比图2发现样品7的酯类和醛类物质含量较低，烃类和醇类物质含量最高，这可能是与其他种类差异较大的原因。

PCA统计方法是将一组可能有相关性的变量通过正交变换的方法转为一组线性不相关变量[34]。图6为10 种松籽油E-nose数据的PCA二维图，PC1、PC2贡献率分别为93.05%、4.12%，总贡献率达97.17%，基本涵盖样品的所有信息，用其代表松籽油的E-nose整体信息可信度非常高。除样品1、2与样品4、6部分重叠外，其他种类松籽油分离得很好。样品7与其他种类距离较远，说明和其他种类相差很大，这与E-nsoe雷达指纹图表达的信息一致。

图610 种红松籽油的E-nose PCA二维图Fig.6 Two-dimensional PCA plot of E-nose data of 10 pine nut oils

图710 种松籽油的E-nose LDA二维图Fig.7 Two-dimensional LDA plot of E-nose data of 10 pine nut oils

运用LDA对不同品系的红松籽油样品进行鉴别。LDA比PCA更注重样品在空间的分布状态及彼此之间的距离分析，此方法让类间散布矩阵最大，同时类内散布矩阵最小，能更好地分析样品间的差异性[37]。由图7可知，LD1和LD2的贡献率分别为81.49%和7.33%，前2 种PC的累计贡献率达88.82%，大于85%，能很好地区分不同品系红松籽油，且分别将样品1和样品2、样品4和样品6分离，区分效果比PCA更好。因此，结合PCA、LDA方法，可弥补PCA对不同类别样品不敏感及LDA算法处理小规模样本的缺憾，进而得到更好的分类效果。因此，在评定不同品系松籽油的挥发性成分时，应综合2 种方法进行分析。

PCA与LDA方法能高效地区分10 种品系的松籽油在挥发性风味成分种类和含量的差异，其中样品7与其他样品间差别较大，样品1和样品2、样品4和样品6共2 组的分离效果欠佳，通过LDA对其进行区分，且分离效果良好。

2.4 E-nose和GC-MS的相关性分析

选择每个种类中前5 种相对含量较高的挥发性化合物进行热图分析[38]，结果如图8所示。10 个样品中，乙酸乙酯、乙酸、3-甲基-戊烷和月桂烯醛是主要化合物。不同品系红松籽油挥发性化合物的组成具有差异性和相似性，样品4、10、8、6具有相似的风味成分，样品3、5与其他样品差异较明显。此外，2,4-癸二烯是样品6相对含量最高的挥发性化合物。(+)-柠檬烯是样品9中相对含量最高的挥发性化合物。

图8 10 种松籽油挥发性化合物的热图Fig.8 Heatmap of the key volatile compounds in 10 pine nut oils

选择GC-MS热图分析中较为丰富的挥发性成分，与E-nose传感器信号进行相关性分析，结果如图9所示。R3、R4、R5和R10传感器的信号强度分别与3-甲基-丁醛、1,4-苯二醇、3-甲基-戊烷和甲酸的丰度相对含量呈高度正相关，这表明R3、R4、R5和R10传感器对碳氢化合物和芳族化合物敏感。相反，R7的信号强度与1,4-苯二醇的相对含量呈负相关，R8和R9信号强度与环己醇的相对含量呈负相关。R1、R2和R6传感器与醛类挥发性化合物具有一定相关性，R1、R2传感器均与十六醛相对含量呈正相关。表明E-nose能够通过对松籽油的挥发性化合物做特殊反应以区分其类别。

图9 10 种松籽油中主要挥发性组分、E-nose和GC-MS之间的相关性Fig.9 Correlation between E-nose and GC-MS data of the key volatile components in 10 pine nut oils

3 结 论

HS-SPME-GC-MS结合E-nose可对不同品系红松籽油挥发性物质进行区别和分类。烃类、醛类、醇类和酯类为10 个品系红松籽油的主要挥发性物质。HS-SPMEGC-MS结合E-nose的方法证明不同品系红松籽油对其挥发性物质影响显著，这2 种技术的相关性分析结果表明，E-nose传感器与不同挥发性物质有相关性，能够通过挥发性物质区分其类别。HS-SPME-GC-MS技术结合E-nose用于区分和比较10 个品系红松籽油的挥发性成分具有理想的可行性。