付雪媛 孙呈浩 王长伟 杜芬 李八方

摘要 [目的]筛选单环刺螠体壁制备海鲜调味基料的最佳工艺。[方法]以单环刺螠体壁为原料，将物理抽提法与酶解法相结合制备海鲜调味基料，分析单环刺螠体壁的基本营养成分、氨基酸组成，并采用单因素试验和正交试验优化酶解工艺。[结果]采用风味蛋白酶进行酶解，最优酶解工艺条件为酶解温度50 ℃、料液比1∶4、加酶量7 000 U/g、酶解时间5 h。在该条件下蛋白水解度为38.23%，所得酶解液风味较好、分子量较低。[结论]将酶解液过滤后与蒸煮所得上清液复合即得到鲜味浓郁、营养丰富的单环刺螠海鲜调味基料，可用于进一步复配加工成相关海鲜调味料。

关键詞 单环刺螠;营养评价;酶解;水解度;海鲜调味基料

中图分类号 TS 254  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2021）18-0168-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.18.041

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Technology Research of Preparation of Seafood Flavor Condiment Base from Urechis unicinctus Body Wall

FU Xue-yuan1，SUN Cheng-hao2，WANG Chang-wei1 et al （1.Marine Biomedical Research Institute of Qingdao，Qingdao，Shandong 266071;2.PONY （Qingdao） Testing International Group Co.，Ltd，Qingdao，Shandong 266061）

Abstract [Objective]To select the best process for preparing seafood flavouring base from single Unicinctus unicinctus body walls.[Method] The physical extraction and enzymatic hydrolysis was combined to prepare seafood flavor condiment base from Urechis unicinctus body wall.The basic nutritional composition，amino acid composition of urechis unicinctus body wall were analyzed;the parameters of enzymolysis were optimized through single factor experiment and orthogonal experiment.[Result] Flavor protease was adopted in the progress of enzymatic hydrolysis，the optimal conditions were as follows：the enzymolysis temperature was 50℃，the solid-liquid ratio was 1∶4，the dosage of enzyme was 7 000 U/g，the enzymolysis time was 5 h，under these conditions，the degree of hydrolysis was 38.23%，the obtained enzymatic hydrolysate has better flavor and lower molecular weight.[Conclusion]The filtered enzymatic hydrolysate will be combined with the supernatant after boiled，and this combined liquid was Urechis unicinctus seafood flavor condiment base，which was rich in nutrients and umami flavor and can be used for further compounding and processing to related seafood seasonings.

Key words Urechis unicinctus;Nutrition evaluation;Enzymatic hydrolysis;Degree of hydrolysis;Seafood flavor condiment base

基金项目

国家自然科学基金青年科学基金项目（51703214） 。

作者简介 付雪媛（1990—），女，山西阳泉人，工程师，硕士，从事海洋水产品高值化利用研究。*通信作者，教授，博士，博士生导师，从事海洋功能制品研究。

收稿日期 2021-02-19

单环刺螠（Urechis unicinctus），俗称海肠，隶属螠虫动物门，主要分布于中国、俄罗斯、日本、朝鲜沿海地区的泥潭或岩石缝中[1]，其营养成分接近海参，因此被誉为裸体海参[2]。单环刺螠营养价值丰富，体壁占总质量的32%左右，含有丰富的蛋白质[3]，氨基酸组成合理，含有多种必需氨基酸。生物活性肽、纤溶酶等含量丰富[4]，呈味氨基酸含量丰富[5]，味道鲜美，是制作海鲜调味料的良好材料。

目前市面上常见的海鲜调味料有鱼露、虾油、耗油等，主要以鱼、虾、贝类为原料，经过抽提、分解、加热、浓缩等工艺[6]，使天然鲜味释放。根据加工方式不同，调味料分为分解型、抽提型和反应型[7]。分解型调味料是通过加酸、加酶、发酵等方式将原料分解，形成富含氨基酸、多肽、有机酸的调味液[8-10];抽提型海鲜调味料是经过抽提、分离、混合等产生鲜味浓郁的天然浸出物，常用方法有水提法、醇提法[11];反应型调味料是通过氨基酸和糖类的美拉德反应制备天然香基，再经调配后得到成品调味料[12-13]。

有学者对以单环刺螠为原料制备海鲜调味料进行研究和开发。在李新民[14]的研究中，将海肠烘烤、粉碎得到海肠粉，经复配得到海肠调味料;刘海梅等[15]采用复合风味蛋白酶或木瓜蛋白酶直接酶解海肠，改善了水解液风味;王思婷等[16]通过风味蛋白酶酶解海肠，再经喷雾干燥制得海肠调味颗粒。该研究创新了提取工艺，将物理抽提法与加酶分解法相结合，研究了酶解工艺条件和工艺参数，所得调味液基料滋味鲜美，既保留了海肠原始风味，又进一步释放鲜味成分，可用于加工成单环刺

螠调味料。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鮮单环刺螠：购自青岛麦岛海鲜水产市场;中性蛋白酶（130 000 U/g）、碱性蛋白酶（220 000 U/g）、风味蛋白酶（130 000 U/g）、胰蛋白酶（350 000 U/g）、复合蛋白酶（52 000 U/g）：南宁庞博生物工程有限公司，食品级;石油醚、甲醛、氢氧化钠：国药集团化学试剂有限公司，分析纯;其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

Agilent 1260高效液相色谱仪，安捷伦科技有限公司;L-8900型氨基酸自动分析仪，日本日立公司;SKD-100型凯氏定氮仪，上海沛欧分析仪器有限公司;QSJ-B03E1型料理机，广东小熊电器有限公司;HWS24型恒温水浴锅，上海一恒科学仪器有限公司;SHA-C型恒温振荡器，常州国华电器有限公司;BSA2202S型电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司;PH400型pH计，安莱立思仪器科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 单环刺螠基本营养成分分析。

水分：参照GB/T 5009.3—2016，直接干燥法测定;灰分：参照 GB/T 5009.4—2016，灼烧法测定;蛋白质：参照GB/T 5009.5—2016，半微量凯氏定氮法测定;总脂：参照GB/T 5009.6—2016，索氏抽提法测定。

1.3.2 氨基酸组成分析。

参照GB/T 5009.124—2016食品中氨基酸的测定。采用氨基酸自动分析仪测定，855-4506型离子交换柱（4.6 mm×60.0mm），柱温57 ℃，泵流速0.4 mL/min，进样体积20 μL，分析时间50 min。

1.3.3 分子量分析。

参照GB 31645—2018进行测定。采用高效液相色谱法，TSK GEL G2000SWXL色谱柱，柱温30 ℃，体积流量0.8 mL/min，流动相为体积比1∶1的乙腈与0.2%三氟乙酸混合溶液，检测波长220 nm，结果通过GPC软件进行分析。

1.3.4 单环刺螠体壁海鲜基料的制备工艺。将单环刺螠体壁置于搅碎机搅碎→调整料液比为1∶2→小火煮沸蒸煮2 h→过滤得上清备用→剩余固体冷却后调整料液比→调节pH→加酶恒温酶解→灭酶→冷却→过滤得上清液→与蒸煮上清液合并→单环刺螠体壁海鲜基料。

1.3.5 酶解单因素试验。

在固定其余因素不变的情况下，分别考察料液比、酶解温度（℃）、酶解时间（h）、加酶量（U/g）对蛋白质水解度的影响，以此数据作为正交试验设计的依据。

1.3.6 酶解正交试验。

在单因素试验的基础上，采用风味蛋白酶，固定酶解液pH为7.5，选择酶解料液比、加酶量、酶解时间、酶解温度为因素，以蛋白质水解度为试验指标，进行4因素3水平正交优化试验。因素水平设计见表1。

1.3.7 蛋白质回收率与水解度测定。

参照GB/T 6432—2018，采用凯氏定氮法测定原料和酶解液中总氮含量;参照GB 5009.235—2016，中性甲醛滴定法测定游离氨基态氮含量。

蛋白质回收率（%）=水解液总氮含量/原料总氮含量 ×100;蛋白质水解度（%）=水解液游离氨基态含量/水解液总氮含量×100

1.4 数据分析

对所有数据利用SPSS18.0统计软件进行处理，多组数据之间统计学差异采用单因素方差分析，P<0.05表示显著性差异。

2 结果与分析

2.1 单环刺螠体壁基本营养成分

由表2可知，单环刺螠体壁水分含量为82.70%，蛋白质含量为12.63%，总脂含量为1.55%，灰分含量为2.22%，其中蛋白质含量占干重的71.01%，含量丰富。

2.2 单环刺螠体壁氨基酸

通过检测18种氨基酸，单环刺螠体壁的氨基酸组成见表3。单环刺螠体壁中谷氨酸含量为非必需氨基酸最高，达到9.81%，其次为甘氨酸（8.86%）、丙氨酸（8.20%），色氨酸未检测出。谷氨酸、丙氨酸和甘氨酸等均为重要的呈味氨基酸，其总和占氨基酸总量比例（DAA/TAA）达到57.35%，这可能是单环刺螠味道鲜美的原因所在。FAO/WHO的理想模式认为，EAA/TAA接近40%营养价值较好。单环刺螠体壁的EAA/TAA为31.17%，较为接近FAO/WHO的标准。

必需氨基酸评分结果见表4。8种必需氨基酸的含量及构成比例是评价蛋白质营养价值的依据，通常以FAO/WHO推荐的EAA模式和蛋氨酸模式进行参比。单环刺螠体壁检测出7种必需氨基酸，其中苏氨酸的AAS评分最高，为1.18，蛋氨酸+胱氨酸的AAS评分最低，为0.52，其余各项氨基酸评分均接近1.00，说明单环刺螠体壁必需氨基酸结构较为合理，基本符合人体对必需氨基酸的需求，具有较高的营养价值。

2.3 酶种类筛选

比较风味蛋白酶、胰蛋白酶、复合蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶对酶解效果的影响，酶解参数见表5。以蒸煮后剩余固体为原料进行酶解，以氮收率和水解度为考察指标，结果见图1。5种蛋白酶中，胰蛋白酶和风味蛋白酶酶解后氮收率分别达到63.10%和61.08%，两者无显著性差异，但显著高于复合蛋白酶、中性蛋白酶与碱性蛋白酶;风味蛋白酶酶解后水解度达到33.25%，显著高于其他4种酶。鉴于风味蛋白酶酶解后氮收率和水解度较高，且酶解液风味较好，因此选择风味蛋白酶为最适宜水解酶。

2.4 酶解单因素试验

2.4.1 不同料液比对水解度的影响。

固定提取温度50 ℃，提取时间4 h，加酶量7 000 U/g，研究不同料液比对蛋白水解度的影响，结果见图2。从图2可见，在料液比为1∶3时，水解度达到最高水平，为30.66%。随着加水量增加，水解度呈下降趋势，原因可能是酶浓度降低，难以充分与单环刺螠蛋白接触，从而难以充分酶解。因此，选择料液比为1∶3作为酶解提取的适宜条件。

2.4.2 不同酶解温度对水解度的影响。

固定料液比1∶3，提取时间4 h，加酶量7 000 U/g，研究不同酶解温度对水解度的影响，结果见图3。从图3可见，随着酶解温度的升高，蛋白水解度不断增大，到50 ℃时水解度最高，达到31.50%，当酶解温度继续升高至60 ℃时，水解度下降至29.10%。温度升高时，酶和底物的分子扩散运动加快，结合速率提高，因此使得水解度不断升高，当达到一定温度后继续升高温度时，酶活力下降，水解度降低，因此选择50 ℃作为风味蛋白酶酶解的适宜温度。

2.4.3 不同酶解时间对水解度的影响。固定料液比1∶3，提取温度50 ℃，加酶量7 000 U/g，研究不同酶解时间对蛋白水解度的影响，结果见图4。从图4可见，在3～6 h，随着酶解时间的延长，水解度不断上升，到6 h时水解度达到32.22%。随着酶解时间的进一步延长，水解度呈下降趋势。过长水解时间可能导致蛋白过度水解产生苦味肽，且提高制备成本。因此，选择6 h作为最佳酶解时间。

2.4.4 不同加酶量对水解度的影响。

固定料液比1∶3，提取温度50 ℃，酶解时间4 h，研究不同加酶量对水解度的影响，结果见图5。由图5可知，随着加酶量的增加，水解度不断上升。当加酶量为7 000 U/g时，水解度达到32.75%，加酶量继续增加，水解度反而下降，当加酶量为11 000 U/g时，水解度为30.67%。这是由于当酶浓度过高时酶与底物接触已经饱和，不会再提高水解效率。因此，选择7 000 U/g作为单环刺螠体壁酶解的适宜加酶量。

2.5 酶解正交优化试验 在单因素试验的基础上，采用风味蛋白酶，固定酶解液pH为7.0，选择酶解料液比、加酶量、酶解时间、酶解温度为因素，以水解度为试验指标，进行4因素3水平正交优化试验，结果见表6。由表6可知，风味蛋白酶酶解单环刺螠体壁过程中，各因素对水解度的影响从大到小依次为料液比、酶解温度、酶解时间、加酶量。最佳酶解条件组合为料液比1∶4，酶解温度50 ℃，酶解时间5 h，加酶量7 000 U/g。在该试验条件下进行验证试验，平行3次，水解度为（38.23±1.32）%，优于最大值38.11%。

2.6 分子量测定 采用液相色谱法分别测定酶解液和酶解前单环刺螠体壁固体分子量，分子量分布见图6。酶解前单环刺螠体壁蛋白质平均分子量为1 886 Da，酶解后分子量为637Da，说明在该试验条件下，风味蛋白酶能够将大分子蛋白质切割为小分子肽段或游离氨基酸，酶解效果显著。

3 结论

该研究以单环刺螠为原料进行基本营养成分分析及氨基酸分析，结果表明，单环刺螠具有高蛋白、低脂肪的营养特点，氨基酸含量丰富，其中必需氨基酸占比达31.17%，呈味氨基酸占比达57.35%，说明单环刺螠不仅营养丰富且味道鲜美，可以作为海鲜调味料的原料进行开发。

将抽提法与酶解法的工艺条件结合，经蒸煮抽提后的单环刺螠体壁进一步酶解，确定风味蛋白酶作为最适宜水解酶，经过单因素试验和正交试验确定最适酶解条件，当酶解条件为酶解温度50 ℃、料液比1∶4、加酶量7 000 U/g、酶解时间5 h时，蛋白水解度最高，为38.23%，且酶解液分子量较低，利于人体吸收;所得的酶解液经过滤后与前期蒸煮过滤得到的上清液合并（为增强基料鲜味的浑厚感）即为单环刺螠海鲜调味料基料，该基料风味鲜美、澄清、无苦味，可用于进一步加工复配成海鲜调味料。该研究为单环刺螠海鲜调味料的开发提供了理论依据。

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