牛浩，段卫东，汪代斌，白金莹，彭军，宋朝鹏，路晓崇*

1 河南农业大学烟草学院，河南郑州 450002；

2 河南中烟工业有限责任公司，河南郑州 450018；

3 重庆烟草科学研究所，重庆 400023

烘烤是决定烟叶最终质量和工业可用性的重要环节。在生产实践中，易出现对采后烟叶变黄变褐特征把握不准确的现象，导致烟叶烤青烤黑，造成经济损失影响烟农收入。本文探讨采后烟叶颜色变化机制为提高烟叶烘烤质量，制定烘烤工艺提供参考。近年来，研究认为果蔬采后衰老和褐变的发生与能量代谢有着密切的联系[1]。Liu等[2]发现外源ATP能够抑制荔枝果皮细胞膜脂过氧化程度，从而延缓褐变发生。刘海[3]指出ATP缺乏引起了香蕉果实细胞膜结构的破坏，加速了香蕉的衰老褐变。而用能量代谢抑制剂（DNP，2,4-二硝基苯酚）浸泡过的龙眼果实果皮褐变明显加快[4]。在烟草领域，采后烟叶的变黄变褐过程及其背后的能量代谢机制尚未见报道。基于此，本研究以烤烟品种（系）“豫烟13号”和“LY1306”为研究对象，采用暗箱试验的方式研究了采后烟叶的变黄变褐过程。通过测定试验期间烟叶的变黄程度、变褐程度、丙二醛含量（MDA）、能量相关物质（ATP、ADP、AMP含量）、能荷以及细胞色素氧化酶（CCO）、琥珀酸脱氢酶（SDH）等呼吸代谢相关酶的活性，来研究采后烟叶变黄变褐特点差异及其背后的能量代谢机理，为提升烟叶烘烤质量，制定适宜烘烤工艺提供理论依据和参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2019—2020年度进行，供试品种（系）为豫烟13号和LY1306。豫烟13号是以中烟101为母本、664-01为父本杂交后培育而成的烤烟纯系品种，大田生育期120 d左右，成熟特征明显，烘烤特性表现为变黄失水容易，易烤性好[5]。LY1306是由系统选育的G80株系以此与K326、89112交育成的烤烟品系，大田生育期约128 d，烘烤特性表现为变黄失水相对困难，易烤性稍差[6]。供试烟叶均产自河南省洛阳市宜阳县石村（N112°3′25″，E34°30′24″）。烟叶田间的移栽，施肥和其他田间管理措施均按照当地优质烟叶生产方法进行。在当地中部叶适熟时期，选取第10～13叶位长相一致，落黄均匀的适熟烟叶各200片进行采收。所有烟叶均在同一天进行采收以保证试验材料的均一性和代表性。采后烟叶立刻送回实验室进行暗箱试验。在暗箱试验期间，每隔24 h随机选取3片烟叶观察变黄变褐情况后放回；每隔48 h随机选取3片烟叶，去除主脉后混合第6至第7支脉叶肉，用液氮速冻后放入超低温冰箱中-80℃保存用于后续统一测定各项生理指标；各项生理指标均重复测定3次。试验开始当天记为第0 d，进行至所有烟叶变褐程度达到30%时结束。

1.2 测定方法

1.2.1 黄化褐变的测定

参考文献[7]的方法，在黑暗、不通风、室温环境下进行暗箱试验。每隔24 h拍照观察一次，目测变黄变褐程度。以烟叶变黄/变褐面积在整个烟叶面积的占比来表示变黄变褐程度，直至所有烟叶的变褐程度均达到30%为止。

1.2.2 丙二醛（MDA）含量的测定

采用硫代巴比妥酸法测定MDA含量[8]。取0.5 g烟草样品置于研钵中，加入2 mL预冷的0.05 mol/L pH7.8的磷酸缓冲液，冰浴下充分研磨。随后将研磨后的匀浆转移到5 mL刻度离心管中，将研钵用缓冲液洗净，清洗液也移入离心管中，用缓冲液定容至5 mL。冷冻离心机4℃，4500 rpm下离心10 min。取上清液2 mL，加入3 mL 0.5%的TBA溶液后放入沸水浴中煮沸10 min。之后立刻将试管取出并放入冰浴中。冷冻离心机4℃，4500 rpm下再次离心10 min。取上清液于532 nm，600 nm波长下测定吸光度，计算MDA含量，结果以nmol/g表示。

1.2.3 ATP、ADP、AMP含量和能荷的测定

采用高效液相色谱法测定ATP、ADP和AMP的含量[9]。取烟草样品2.0 g，液氮研磨后加入1 mL 0.4 mol/L 高氯酸溶液继续研磨20 min。随后冷冻离心机4℃，14000 rpm下离心10 min。上清液用1 mol/L氢氧化钾溶液调节pH至6.5～6.8后定容至5 mL。定容后的样本经0.45 μm孔径微孔滤膜过滤，应用高效液相色谱仪（Agilent 1260）进行检测。色谱柱为Diamonsil C18(2)（250*4.6 mm，5 μm），流动相为磷酸缓冲盐溶液，磷酸盐缓冲液（含20 mmol/L的磷酸二氢钾和20 mmol/L的磷酸氢二钠，pH=6.5）—乙腈（99：1，v:v），流速为1 mL/min，柱温为30℃。检测波长254 nm。进样量为10 μL，重复3次。ATP、ADP、AMP标准品（购自上海源叶生物）重复上述过程制作标准曲线，根据各物质峰面积带入标准曲线计算ATP、ADP、AMP含量。

根据公式（1）计算能荷（EC）

1.2.4 烟草叶片线粒体的提取

参考Hiroshi等[10]的方法提取烟叶线粒体，略有改动。称取1 g烟叶，加入10 ml缓冲液（50 mmol/L pH7.5 Tris-HCL缓冲液，内含0.3 mol/L 甘露醇、1 mmol/L EDTA二钠盐、质量分数为0.1% PVP）冰浴匀浆。接着四层纱布过滤，滤液在4℃ 4000 g下离心10 min；取上清液转移到新的离心管中，在4℃14000 g条件下离心20 min。弃上清液，将沉淀用前述缓冲液洗涤，在4℃ 14000 g下离心20 min，沉淀即为线粒体。将沉淀用1.5 mL缓冲溶液溶解，用于后续指标的测定。

由表2可以看出，除处理⑥和处理⑦污泥中Cd含量超过 《城镇污水处理厂污泥处置－农用泥质标准》A级标准但低于B级标准（A标准是Cd含量＜3 mg/kg，B 标准是 Cd 含量＜15 mg/kg）外，其余重金属指标均符合A级标准，可用于种植锦紫苏。

1.2.5 线粒体琥珀酸脱氢酶（SDH）的测定

参考Ackrell等[11]和陈京京[12]的方法测定琥珀酸脱氢酶（SDH）的活性。取线粒体制备液0.1 mL，加入在30℃预热的工作液中（内含0.2 mol/L pH7.4磷酸钾缓冲液，0.2 mol/L 琥珀酸钠和0.9 mmol/L 2,6-DCPIP）。混匀后，30℃下保温5 min。立即加入质量分数为0.33%的甲硫酚嗪溶液摇匀，测定600 nm处吸光值的变化来表示SDH的活性。

1.2.6 线粒体细胞色素氧化酶（CCO）的测定

参考Kan等[13]方法测定细胞色素氧化酶的活性，略有改动。取线粒体制备液0.1 mL，加入质量分数为0.04%的细胞色素C水溶液0.2 mL和蒸馏水2 mL（37℃预热）。接着加入0.5 mL质量分数为0.4%的二甲基对苯二胺水溶液37℃保温至出现红色，颜色在10 min内稳定。于540 nm比色，用秒表计时，以变化的吸光值度表示CCO活性。

1.3 数据分析

数据采用Excel进行数据整理分析；采用Origin 7.5作图；采用SPSS 17.0进行方差分析、相关分析、回归分析和显著性检验。

2 结果与分析

2.1 采后烟叶黄化褐变的发展

豫烟13号和LY1306两品种（系）烟叶的变黄变褐情况图1所示，详细情况展示在图2中。可以看出，在变黄程度上，豫烟13号变黄较快，采后5 d烟叶已经到十成黄；LY1306变黄相对缓慢，变黄十成用时7 d。在变褐程度方面，豫烟13号的褐变启动也较早，在采后5 d出现了变褐的现象，在8 d时叶片已经达到三成褐；LY1306褐变出现较晚，在采后7 h表现出变褐迹象，在10 d时烟叶达到三成褐。

图1 采后烟叶变黄变褐特征Fig.1 Characteristics of yellowing and browning of postharvest tobacco leaves

图2 豫烟13号和LY1306采后烟叶的变黄和变褐特征Fig.2 The characteristics of yellowing and browning of Yuyan 13 and LY1306 postharvest tobacco leaves

2.2 采后烟叶丙二醛含量的变化

由图3可知，豫烟13号和LY1306采后烟叶MDA含量呈现出大致相同的趋势，表现为持续上升。在采后0～4 d，两品种（系）烟叶MDA含量差异不显著。采后6～10 d，豫烟13号的MDA含量高于LY1306，且第8 d、第10 d的差异达到了显著水平（P＜0.05）。说明LY1306采后烟叶的膜脂过氧化发展较慢，细胞膜完整性能维持较长时间。

图3 采后烟叶MDA含量和变化Fig.3 Change of MDA content in postharvest tobacco leaves

2.3 采后烟叶ATP、ADP、AMP含量及能荷值的变化

能荷水平是指在总的腺苷酸系统中所负荷的高能磷酸基的数量，一定程度上反映了细胞整体的能量状态。由图3-D可知，两品种（系）烟叶的能荷值随时间的变化趋势基本一致，都呈现出先上升后平缓的趋势，但豫烟13号能荷水平始终高于LY1306。

2.4 采后烟叶细胞色素C还原酶（CCO）活性的变化

由图4可知，LY1306和豫烟13号两品种（系）采后烟叶CCO酶活性的变化基本一致，都表现出先上升后下降的趋势。两品种（系）烟叶CCO酶活性的峰值都出现在第2 d，但此时LY1306的CCO活性要显著高于豫烟13号（P＜0.05）。随后，两品种（系）烟叶CCO酶活性都出现下降，但LY1306活性下降更多。在采后4～10 d，豫烟13号的CCO酶活性始终高于LY1306。CCO是位于线粒体内膜上参与氧化磷酸化反应的关键酶，也是呼吸链上的末端氧化酶，其主要功能是把呼吸底物上的电子传递给分子态氧，能够反应细胞有氧呼吸的代谢水平。上述结果表明，豫烟13号采后烟叶CCO活性能够长时间维持较高水平，有氧呼吸活动更加旺盛。

图4 采后烟叶ATP(A)、ADP(B)、AMP(C)含量及能荷值(D)的变化Fig.4 Changes of ATP(A), ADP(B), AMP(C) content and EG(D) of postharvest tobacco leaves

2.5 采后烟叶琥珀酸脱氢酶（SDH）活性的变化

由图5可以看出，两品种（系）采后烟叶SDH活性均呈现出先增加而后减少的趋势。不同的是，豫烟13号的SDH活性高峰出现在第2 d，而LY1306的SDH活性高峰出现在第6 d。除开始时和第6 d外，豫烟13号的SDH活性均高于LY1306。琥珀酸脱氢酶（SDH）是TCA循环中唯一一个整合于膜上的酶类，也是连接氧化磷酸化与电子传递的枢纽之一。同时，SDH可为真核细胞线粒体和多种原核细胞需氧和产能的呼吸链提供电子，反映了细胞有氧呼吸的状态。以上结果表明，豫烟13号采后烟叶SDH活性较高，促进了TCA循环的顺利进行，有氧呼吸作用更加旺盛。

图5 采后烟叶细胞色素C还原酶（CCO）活性的变化Fig 5 Change of CCO activity in postharvest tobacco leaves

图6 采后烟叶琥珀酸脱氢酶（SDH）活性的变化Fig.6 Change of SDH activity in postharvest tobacco leaves

2.6 采后烟叶能量代谢和变黄变褐程度的相关性分析

为明确能量的代谢与采后烟叶变黄变褐的关系，对两品种（系）烟叶变黄变褐程度与ATP、ADP、AMP及能荷进行相关性分析。由表2可知，ATP、AMP和能荷与变黄程度的相关系数分别为0.934**、0.809**和0.835**，且均达到了极显著水平（P＜0.01），ADP含量与变黄程度呈现负相关关系（-0.360）；ATP、ADP、AMP和能荷与变褐程度的相关系数分别为0.722**、0.626*、0.931**和0.765**，ATP、ADP、AMP和能荷与变褐程度的相关关系达到了极显著水平（P＜0.01），ADP与变褐程度的相关关系达到了显著水平（P＜0.05）。变黄程度与ATP、AMP和能荷的相关系数较大，变褐程度与AMP的相关系数较大，表明能量代谢水平与烟叶变黄变褐程度关系密切。

表2 采后烟叶能量代谢与变黄变褐程度的相关性分析Tab. 2 Correlation analysis between energy metabolism and the degree of yellowing and browning of postharvest tobacco leaves

2.7 采后烟叶能量代谢与变黄变褐程度的回归分析

分别以暗箱试验中烟叶的变黄程度（Y1）、变褐程度（Y2）为因变量，以ATP（X1）、ADP（X2）、AMP（X3）、能荷（X4）作为自变量进行回归分析，建立起采后烟叶能量代谢对颜色变化贡献的预测方程：

Y1=-45.951-0.707X1+2.879X2+6.208X3+63.458X4（R2=0.950，P＜0.01）；

Y2=8.528+0.296X1-0.758X2+19.781X3-13.009X4（R2=0.908；P＜0.01）。

回归分析的结果表明，采后烟叶的变黄程度和变褐程度与ATP、ADP、AMP和能荷回归方程拟合度较好，均达到了极显著水平（P＜0.01），说明能量代谢水平对采后烟叶的颜色形成有较大的影响。

3 讨论

自田间采收的成熟烟叶虽然脱离了植株母体，但仍然处于生命活动状态。此时，烟叶自身活动所需的能量只有靠呼吸作用不断分解自身有机物来提供。园艺作物相关研究指出，果蔬采后衰老褐变与能量代谢活动存在密切联系。在桃[12,14]、双孢蘑菇[15]、枇杷[16]的研究中均观察到褐变的发生与ATP含量和能荷值呈现负相关关系，其机理可能是ATP参与脂质的合成与脂肪酸的去饱和作用，从而影响膜的理化性质和生理功能[17-18]。采后烟叶的变黄变褐过程涉及一系列复杂的生理生化机制。一般认为，烟叶黄化褐变的发生是由于膜脂过氧化作用加剧，烟叶细胞死亡，细胞膜间的分隔作用被打破导致酶和底物结合引起的[19-20]。从能量代谢的角度出发，烟叶黄化褐变最终走向死亡这一过程是能量代谢失衡的结果[21]。在本试验中，采后烟叶在暗箱条件下ATP、ADP含量和能荷表现出先上升后下降，AMP含量表现出增加的趋势，同时伴随着MDA含量的上升和变黄变褐程度的加重。这表明在采后一段时间烟叶的能量代谢活动先是加强而后出现下降，这与前人的研究结果有相似之处[22-24]。采后烟叶ATP和ADP含量首先表现出上升，可能是由于烟叶采收后处于一个离体的逆境环境之中，需要更多的能量来应对各种环境胁迫以维持其生命活动的正常进行[25]。但这种提升只是暂时的，随着逆境的加深以及烟叶内的呼吸底物的减少，此时烟叶细胞内产能活动已经不能满足需求。此时，大量的ATP分解为ADP，同时ADP进一步分解为AMP为细胞提供能量，造成ATP、ADP含量下降，而AMP含量的上升的现象。相关性分析表明，变黄程度与ATP、AMP和能荷相关性较强，相关系数分别为0.934**、0.809**和0.835**（P＜0.01）；变褐程度与AMP相关性较强，相关系数为0.931**（P＜0.01），提示采后烟叶的变黄变褐过程可能与其能量代谢活动有关。此外，试验中观察到两品种（系）烟叶的ATP含量和能荷值的高峰与烟叶全黄的时间几乎一致，这与采后果实生理中的“呼吸跃变”现象相似[26]。在梨、香蕉等果实的研究中也报道了呼吸跃变与其颜色变化的关联性[27-28]，表明能量代谢水平与烟叶的黄化褐变过程可能存在一定的因果关系。豫烟13号和LY1306一定程度上代表了烟叶的易烤性和耐烤性两个方面。从能量代谢的角度来看，易烤性好的烟叶代表其逆境环境敏感，能量代谢提升迅速，变黄启动早变黄快且容易变褐；耐烤性好的烟叶代表其对逆境环境耐受性较强，能量代谢提升相对缓慢，变黄启动晚且不易变褐。在本研究中，豫烟13号采后烟叶ATP含量和能荷水平更高且更早达到高峰，变黄启动更早也更易变褐，表明豫烟13号烟叶对逆境环境表现更敏感，在烤房中也更易变黄；LY1306采后烟叶能量代谢活动高峰出现较晚，变黄启动时间和褐变发生也更晚，表明LY1306受逆境环境的耐受性较强，提示高水平的能量代谢活动可能加速了采后烟叶的黄化褐变过程。Meyer[29]的研究也指出衰老的烟草叶片的反而能够保持较高的能荷值，这与在果蔬研究中提出的“能量缺乏”的观点相反[30]。其原因可能是高水平的能量代谢活动会产生大量的活性氧[31]，破坏烟叶细胞膜的完整性，加速了采后烟叶变黄变褐的过程。

线粒体是细胞能量代谢的枢纽，通过氧化磷酸化作用为各种生命活动提供能量[32]。细胞色素氧化酶（CCO）是位于线粒体内膜上参与氧化磷酸化反应的关键酶，也是呼吸链上的末端氧化酶，其主要功能是把呼吸底物上的电子传递给分子态氧[33]。琥珀酸脱氢酶（SDH）是TCA循环中唯一一个整合于线粒体膜上的酶类，可为真核细胞线粒体和多种原核细胞需氧和产能的呼吸链提供电子[34]。SDH和CCO是反应线粒体功能的标志酶。在本试验中，采后烟叶SDH和CCO酶活性呈现出先上升后下降的趋势，与ATP含量的变化相一致。与LY1306相比，豫烟13号SDH和CCO活性明显处于较高水平，这表明豫烟13号对采摘的响应更强烈，有着更高水平的能量代谢活动。高水平的能量代谢伴随着强烈的氧化磷酸化活动造成活性氧的积累，过剩的活性氧会诱导或加剧膜脂过氧化，从而导致了豫烟13号变黄变褐更早更快的发生[35]。除SDH和CCO活性外，能量代谢活动还受到一系列因素的影响[36]。有研究指出烘烤过程中豫烟13号烟叶淀粉酶的活性较高[37]，这可能是其能量代谢活动旺盛的原因之一。从生产的角度出发，继续研究烟叶的哪些与能量代谢相关的性状（如呼吸底物的含量、组成、呼吸酶活性等）影响了其对采后逆境的敏感性，是改善品种烘烤特性，制定适宜烘烤工艺时应首要考虑的问题。

4 结论

（1）随着采后时间的延长，烟叶的变黄程度、变褐程度和MDA含量逐渐增加。与LY1306相比，豫烟13号烟叶变黄变褐发生的早，MDA含量增长较快。（2）采后烟叶的ATP和ADP含量呈现出先上升后下降的趋势，AMP含量则逐渐上升。与LY1306相比，豫烟13号采后烟叶ATP含量、AMP含量和能荷较高，而ADP含量较低，表明豫烟13号采后能量代谢活动较高。（3）豫烟13号采后烟叶的SDH和CCO活性比LY1306更高，活性下降的也更缓慢，表明豫烟13号的线粒体功能保持更好，产能活动和氧化磷酸化水平更旺盛。（4）相关分析表明，变黄程度与ATP、AMP和能荷相关性较强，相关系数分别为0.934**、0.809**和0.835**（P＜0.01）；变褐程度与AMP相关性较强，相关系数为0.931**（P＜0.01），回归分析表明采后烟叶的变黄程度和变褐程度与ATP、ADP、AMP和能荷的回归方程拟合度较好。（5）与LY1306相比，豫烟13号更容易变黄和变褐，能量代谢活动更旺盛。采后烟叶的变黄变褐过程可能与其能量代谢活动有关。