贺 靖, 杨 双, 刘 娟, 刘达琳, 郭婧玮, 谭云洪, 袁仕善*

(1. 湖南师范大学医学院医学检验系 小分子靶向药物研究与创制湖南省重点实验室，湖南 长沙 410013； 2. 湖南师范大学 附属第一医院检验科，湖南 长沙 410013； 3. 湖南省胸科医院 检验科，湖南 长沙 410013)

结核病(Tuberculosis，TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)感染引起的一种慢性传染病。据WHO统计，2018年全球新发结核病约700万例[1]。目前结核病诊断主要基于细菌镜检和细菌培养，但细菌镜检的敏感性较低，细菌培养耗时长。MTB抗体检测是结核病诊断的有效辅助方法[2]。热休克蛋白16.3(Heat shock protein 16.3，Hsp16.3)在MTB感染早期大量分泌[3]，其免疫原性强，能诱发机体产生特异性抗体，在结核病的诊断中具有一定价值[4]。金纳米棒是在阳离子洗涤剂的胶束溶液中制备的呈棒状、各向异性金纳米颗粒[5]，其具有局部表面等离子体共振(LSRR)性质，可以利用LSRR的波长偏移检测分子对于金纳米棒的吸附，在疾病诊断中具有应用价值[6-7]。本研究建立Hsp16.3的纳米金免疫传感器检测结核病患者血清Hsp16.3抗体，为结核病诊断提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与载体 结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)标准株H37Rv由湖南省胸科医院检验科提供；大肠埃希菌(Escherichiacoli)JM109、原核表达载体pQE30来自小分子靶向药物研究与创制湖南省重点实验室；克隆载体pMD18-T购自大连宝生物工程公司。

1.1.2 培养基 LB培养基。

1.1.3 主要试剂与仪器 限制性核酸内切酶BamH Ⅰ、Hind Ⅲ购自大连宝生物工程公司；Ni-NTA购自美国Novogen公司；十一巯基十一烷酸(MUA)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)购自上海晶纯试剂有限公司；磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Saline，PBS)、增强化学发光(Enhanced Chemiluminescence，ECL)试剂盒购自上海碧云天技术有限公司；吐温-20购自上海生工生物工程有限公司；十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、氯金酸(AuCl3)、硼氢化钠(NaBH4)、抗坏血酸(Vitamin C)购自国药集团化学试剂有限公司。恒温培养箱(PYX-250S-A，广东科力实验仪器有限公司)；电子分析天平(PL403，瑞士Mettler Toledo公司)；磁力搅拌器(JBZ-14，上海大浦仪器有限公司)；高速冷冻离心机(5804(R)，德国Eppendorf公司)；紫外可见分光光度计(UV1750，日本Shimadzu公司)。

1.2 方法

1.2.1 病例入选标准及分组 结核病诊断参照国家卫生健康委员会制定的《肺结核诊断标准》，2019年7月至2020年1月于湖南省胸科医院检验科收集MTB痰培养阳性且临床诊断为结核病的患者标本50例(痰涂片阳性12例，阴性38例)。同期于湖南师范大学附属第一医院收集非结核肺病标本42例(肺炎9例、COPD 20例、肺癌5例、支气管性疾病8例)和体检健康者标本50例。本研究方案经过湖南师范大学医学院伦理委员会批准同意。

1.2.2 pQE30-hsp16.3的构建 根据GenBank中hsp16.3基因序列设计并合成引物。以MTB H37Rv株基因组DNA为模板，PCR扩增hsp16.3基因，与克隆载体pMD 18-T连接，转化至大肠埃希菌 JM109感受态细胞，PCR和测序鉴定。将阳性克隆与表达载体pQE30的DNA分别用BamH Ⅰ和HindⅢ进行双酶切，分离酶切的目的基因和载体，切胶回收、连接，转化至大肠埃希菌JM109感受态细胞，PCR和双酶切鉴定重组子。

1.2.3 Hsp16.3的表达纯化与反应原性分析 挑取阳性重组子菌落于5 mL 含100 mg/L氨苄青霉素的LB中，37 ℃培养过夜，转入500 mL 含100 mg/L氨苄青霉素的LB中，37 ℃培养至A600值约为0.6，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为1.0 mmol/L，37 ℃震荡培养4 h，3 000 r/min、4 ℃离心收集菌体，重悬于裂解缓冲液中，冰浴超声裂解菌体，12 000 r/min离心15 min，收取上清，Ni-NTA柱纯化蛋白。重组Hsp16.3经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离和转移电泳，固定于硝酸纤维素(NC)膜上，分别与1∶100稀释的结核病患者和体检健康者的混合血清孵育，4 ℃作用过夜，用含0.05%吐温-20的PBS洗涤3次，与1∶5 000稀释的HRP-羊抗人IgG孵育2 h，PBST洗涤3次，ECL观察结果。

1.2.4 金纳米棒溶液的制备 于10 mL 0.1 mol/L CTAB中加入240 μL 0.02 mol/L HAuCl4和5 mL超纯水，逐滴加入0.6 mL 0.01 mol/L NaBH4，溶液由橙色经无色变为稳定的棕色，于磁力搅拌器上充分搅拌，得晶种溶液，25 ℃放置4 h后用于金纳米棒的制备。于30 mL 0.1 mol/L CTAB中加入0.8 mL 0.01 mol/L AgNO3和1.5 mL 0.02 mol/L HAuCl4，逐滴加入抗坏血酸，充分搅拌至溶液恰好褪为无色，继续搅拌2 min获得金纳米棒成长液；加入制备好的晶种溶液，25 ℃生长12～24 h，溶液颜色稳定后呈酒红色，测定溶液的纵向等离子体吸收峰波长(LPW)和横向等离子体吸收峰波长(TPW)。

1.2.5 纳米金免疫传感器的制备 向10 mL金纳米棒溶液中加入2 mL 0.005 mol/L MUA，25 ℃静置过夜；10 000 r/min离心15 min，弃上清，用0.01 mol/L CTAB重悬沉淀，加入EDC和NHS室温活化40 min，10 000 r/min 离心15 min，弃上清；用0.01 mol/L CTAB重悬沉淀，测定LPW和TPW。向活化后的金纳米棒溶液中加入适当浓度的Hsp16.3，25 ℃连接2 h，测定LPW和TPW。

1.2.6 纳米金免疫传感器测定血清抗体 于构建的纳米金免疫传感器中分别加入1∶1 000稀释的结核病患者、非结核肺病患者、体检健康者的血清。25 ℃反应2 min，测定LPW和TPW。计算反应前后LPW的红移值，根据红移值绘制ROC曲线，利用ROC曲线确定最佳界值，获得检测灵敏度和特异度。

2 结果与分析

2.1 重组表达质粒的构建

重组表达质粒pQE30-hsp16.3经过PCR和双酶切的结果见图1。PCR和双酶切均得到大小约为440 bp的条带。

2.2 重组蛋白的表达纯化及反应原性分析

纯化Hsp16.3的电泳图谱见图2，经10% SDS-PAGE分离获得大小约16 kD的单一条带。Hsp16.3的WB结果见图3，约16 kD处显示出特异的反应条带，提示Hsp16.3具有良好的反应原性。

图1 重组pQE30-hsp16.3的鉴定Fig.1 Identification of recombinant pQE30-hsp16.3M：标准分子量DNA；1：pQE30-hsp16.3双酶切产物；2：菌落PCR空白对照；3：pQE30-hsp16.3菌落PCR产物M: Standard molecular weight DNA; 1:Double enzyme digestion product of pQE30-hsp16.3; 2:Blank control;3:Colony PCR product of pQE30-hsp16.3

图2 重组Hsp16.3的SDS-PAGEFig.2 SDS-PAGE of recombinant Hsp16.3 M：标准分子量蛋白质；1：纯化Hsp16.3；2：重组菌裂解液上清；3：经IPTG诱导的重组菌；4：未经IPTG诱导的重组菌M: Standard molecular weight protein; 1: Purified recombinant Hsp16.3; 2: Supernatant of lysates of recombinant bacteria; 3: Recombinant bacteria induced by IPTG; 4: Recombinant bacteria without IPTG induction

2.3 纳米金免疫传感器的制备

活化后金纳米棒的LPW为823 nm，TPW为525 nm。与Hsp16.3连接后的LPW为834 nm，较之前红移11 nm，提示抗原修饰成功，结果见图4。利用纳米金免疫传感器检测血清样本，与结核病患者、非结核肺病患者、体检健康者的血清反应的LPW分别为846、836、835 nm。近红外(Vis-NIR)吸收光谱显示，与结核病患者血清反应LPW红移12 nm，与非结核肺病患者血清反应LPW红移2 nm，与体检健康者血清反应LPW红移1 nm。提示Hsp16.3纳米金免疫传感器构建成功，结果见图5。

图3 Hsp16.3的反应原性分析Fig.3 Reactivity analysis of purified Hsp16.3 M：标准分子量蛋白质；1：与体检健康者血清反应；2：与结核病患者血清反应 M: Standard molecular weight protein; 1: Hsp16.3 reacted with serums of healthy subjects; 2: Hsp16.3 reacted with serums of tuberculosis patients

图4 金纳米棒抗原修饰前后的Vis-NIR吸收光谱Fig.4 Vis-NIR absorption spectra of gold nanorods before and after antigen modificationa:抗原修饰前； b：抗原修饰后a: Gold nanorods before antigen modification； b: Gold nanorods after antigen modification

2.4 Hsp16.3的纳米金免疫传感器检测结核病抗体

对50份结核病患者血清进行检测，41份的LPW红移了4～28 nm；对42份非结核肺病患者血清进行检测，35份的LPW红移值小于3.5 nm；对50份体检健康者血清进行检测，49份的LPW红移值小于3.5 nm，红移情况见图6。当红移值为3.5时，尤登指数(敏感度+特异性-1)最大，因此采用3.5作为判别值，ROC曲线见图7，ROC曲线分析见表1，检测结果见表2。

图5 纳米金免疫传感器与血清反应的Vis-NIR吸收光谱Fig.5 Vis-NIR absorption spectrum of gold nanorod immunosensor reacted with serum a：与血清反应前的金纳米棒；b：与结核病患者血清反应的金纳米棒；c：与非结核肺病患者血清反应的金纳米棒；d：与体检健康者血清反应的金纳米棒a: Gold nanorods before reaction with serums; b: Gold nanorods reacted with serums of tuberculosis patients; c: Gold nanorods reacted with serums of nontuberculous pulmonary disease patients; d: Gold nanorods reacted with serums of healthy subjects

图6 Hsp16.3的纳米金免疫传感器检测血清Hsp16.3抗体Fig.6 Detection of antibodies to Hsp16.3 by gold nanorod immunosensor with recombinant Hsp16.3

表1 ROC曲线分析结果

图7 Hsp16.3的纳米金免疫传感器检测Hsp16.3抗体的ROC曲线Fig.7 ROC curve of gold nanorod immunosensor with recombinant Hsp16.3 for detection of the antibodies to Hsp16.3

表2 Hsp16.3的纳米金免疫传感器的检测结果

3 讨 论

Hsp16.3是MTB感染期表达的主要抗原之一[8]。Rabahi等[9]和Bothamley等[10]发现Hsp16.3在结核病患者体内诱发特异性体液反应，产生Hsp16.3抗体。杨双等[11]发现Hsp16.3是能被结核病患者血清特异性识别的血清学抗原。采用Hsp16.3检测Hsp16.3抗体将为结核病诊断提供重要支撑。

金纳米棒具有广泛的有机结合能力和较低的细胞毒性，在生物医学领域具有良好的应用前景[12-13]。基于Au NRs的传感器技术在感染性疾病[14-15]、癌症[16]、阿尔茨海默症[17]等疾病的诊断中进行了诸多研究。Huang等[18]开发了一种利用多种金纳米棒同时进行多重检测的生物分析方法，实现了对日本血吸虫和MTB感染的诊断。Sun等[19]以CFP10-ESAT6为抗原研制了基于LSPR的生物传感器检测MTB抗体，灵敏度达79%，特异性达92%。

本研究将金纳米棒与MTB Hsp16.3抗源连接后，建立纳米金免疫传感器，通过检测金纳米棒纵向等离子体峰波长(LPW)的红移来反映抗原抗体的结合情况，由此辅助诊断结核病。Hsp16.3的纳米金免疫传感器分别对结核病患者、非结核肺病患者、体检健康者的血清进行检测，通过比较反应前后金纳米棒的LPW红移值，分析其在结核病血清抗体检测中的应用价值。与非结核肺病患者和体检健康者的LPW红移值相比，结核病患者的LPW红移值明显增加。ROC曲线分析表明，该方法诊断结核病的灵敏度为82%，特异性为98%，提示检测结核病血清抗体可用于结核病的辅助诊断。该方法的建立为结核病诊断方法的研究提供了有益的思路。