郭艳霞，李孟伟，唐振华，彭丽娟，彭开屏，谢芳，谢华德，杨承剑

（中国农业科学院广西水牛研究所，农业农村部广西水牛遗传繁育重点实验室，广西南宁530001）

反刍动物瘤胃内环境是瘤胃正常发酵的重要保障，瘤胃内复杂的微生物发酵系统共同作用，协助机体对纤维素、非蛋白氮等物质的利用。此过程会以甲烷形式损失掉5%的饲料能量［1］，另外，甲烷作为生物温室气体也会污染环境。很多研究者致力于抑制甲烷生成的研究，通过添加耗氢化合物是减少甲烷排放的主要方法之一［2］。硝酸盐可作为耗氢化合物降低甲烷产量，并且作为非蛋白氮还可为瘤胃微生物提供氮源［3］。Huyen等［4］将硝酸盐作为唯一非蛋白氮源添加到低蛋白质饲粮中，并给动物4周左右的适应期，并未对动物产生毒害作用。Li等［5］在羔羊日粮中添加硝酸钙，发现每千克增重甲烷排放量降低17.3%，每千克干物质日粮甲烷排放量降低35.4%。然而，反刍动物瘤胃微生物还原硝酸盐的过程中产生一种中间产物亚硝酸盐，若未经硝酸盐适应的动物突然摄入大量硝酸盐会造成瘤胃内亚硝酸盐中毒，因此控制硝酸盐的添加量和适应性对于硝酸盐在反刍动物生产中的应用至关重要。

亚油酸是指含18碳原子2个双键的ω-6系多不饱和脂肪酸，在反刍动物瘤胃微生物作用下，第一步cis-11双键被异构化为trans-12双键，产生亚油酸的异构体共轭亚油酸cis-9，trans-11CLA；第二步经过微生物加氢作用，先被还原成反式油酸（t11-C18：1），再进一步还原生成硬脂酸（C18：0）［6］。共轭亚油酸（conjugated linoleic acid，CLA）具有抗癌、减轻动脉硬化、降低体脂、增强免疫力等作用［7］，是维持机体细胞构成所必需的营养物质，提高动物产品CLA含量具有重要意义。亚油酸的氢化过程和甲烷生成过程均存在氢转移，并且需要瘤胃微生物的作用，添加硝酸盐对氢转移过程和瘤胃微生物的影响的相关报道较少。因此，本试验旨在研究添加亚油酸条件下不同剂量硝酸钠对水牛瘤胃体外发酵脂肪酸组成及相关微生物数量的影响。

1 材料与方法

1.1 试验动物及材料

试验时间为2019年3－5月。选择3头体重约为（650±50）kg安装永久性瘤胃瘘管的母水牛作为瘤胃液供体动物。瘘管牛的饲粮水平参照广西水牛研究所的日常饲料配方配制，精粗比40∶60，每天饲喂2次，自由饮水。在晨饲前采集3只瘘管牛的瘤胃内容物，混合后经2层纱布过滤2次至预热处理过和提前通入CO2的收集瓶中，39℃下连续通入CO2。

发酵底物豆粕、玉米（Zea mays）、象草（Elephantes herba）均采自广西水牛研究所水牛场，经65℃烘干制成风干样后，粉碎过0.425 mm孔径筛网用于体外发酵。硝酸钠（分析纯）购于天津市百世化工有限公司；亚油酸标准品（纯度≥99%）购于美国Sigma公司；其他化学试剂均为分析纯。

1.2 试验设计

采用单因素试验设计，根据硝酸钠添加量的不同分为4组，硝酸钠的添加量分别为0（对照）、1、2、3 mg·mL－1，每组5个重复，每组都添加0.25 mg·mL－1的亚油酸。

1.3 培养方法

采用体外批次培养法（重复试验2次，2次对照组产气量相对偏差小于10%），体外发酵底物的精粗比为40∶60（风干基础），底物饲料分为精饲料（豆粕25%，玉米15%）和粗饲料（象草60%），其营养成分见表1。根据试验设计，准确称取发酵底物300 mg象草粉，125 mg豆粕粉，75 mg玉米粉置入180 mL厌 氧 培养瓶中，分别添加不同剂量的硝酸钠。人工瘤胃缓冲液的配制参照Menke等［8］的方法，持续通入CO2气体，缓冲液由粉色变为无色。将乳化后的亚油酸液按相应设定比例加入培养瓶中，人工瘤胃缓冲液和瘤胃液体积2∶1混合均匀，抽取60 mL混合液加入培养瓶中，然后用橡胶塞和铝盖密闭，整个过程通入CO2气体保持厌氧环境，尽快完成。将培养瓶置于恒温水浴摇床中，水浴温度（39.0±0.5）℃，振荡频率50 r·min－1。

表1 底物组成及营养水平Table 1 Composition and nutrient levels of the substrate

1.4 样品采集及分析

在培养3、6、9、12、24 h时，分别测定发酵瓶的产气量和甲烷产量。取一带软细短管的注射器针头，与100 mL润滑的玻璃注射器连接，将针头插入发酵瓶塞子，读取注射器上的刻度并记录数据。培养瓶净产气量（mL）=时间段产气量（mL）－对应时间段空白均产气量（mL），24 h累积总产气量即各时间段培养瓶净产气量之和。用注射器测完产气量，旋转管塞排出管内气体，然后用手动进样针从发酵瓶抽取10 μL气体测定甲烷含量，直接进样至气相色谱仪（Agilent 7890A，美国安捷伦科技公司），色谱柱为HP-INNOWAX（19091N-133）毛细管柱，规格为30 m×0.25 mm×0.25 μm，参照胡伟莲等［9］的测定方法，测定条件为：柱温80℃；气化室温度100℃；检测室温度120℃；载气为高纯氮气，压力179.5 Pa，总流量46.2 mL·min－1，柱流量2.7 mL·min－1，分流比15∶1，吹扫流量3 mL·min－1，循环流量100 mL·min－1；氢气流量40 mL·min－1，空气流量400 mL·min－1。24 h累积甲烷产量即各时间段培养瓶甲烷实际产量之和。

在培养24 h结束时，终止发酵。收集培养液，分别测定pH、氨态氮（ammonia nitrogen，NH3-N）、微生物蛋白（microbial protein，MCP）、挥发性脂肪酸（volatile fatty acid，VFA）、中长链脂肪酸和微生物数量等指标。用pH计（HANNA HI 8424，上海何亦仪器仪表有限公司）测定培养液pH值，测定前pH计先用缓冲液进行校正；采用苯酚－次氯酸钠比色法［10］测定NH3-N含量；采用考马斯亮蓝G250染色法测定MCP含量；参照Li等［11］的方法测定VFA含量；采用气相色谱仪（Agilent 7890A，美国安捷伦科技公司）测定巴豆酸作内标物，色谱柱为HPINNOWAX（19091N-133）毛细管柱，自动进样器（Agilent G4513A，美国安捷伦科技公司），测定条件：气化室温度200℃；检测室温度220℃；柱温采用程序升温：80℃持续1 min，以15℃·min－1升温至170℃后维持1.5 min；载气为高纯N2，压力100 kPa，总流量63.8 mL·min－1，柱流量1.19 mL·min－1，分流比50∶1，吹扫流量3 mL·min－1，循环流量30 mL·min－1；氢气流量40 mL·min－1，空气流量400 mL·min－1；进样量2.0 μL；采用氯仿/甲醇/BHT提取法测定瘤胃液中长链脂肪酸；采用硫酸甲醇酯化法测定甲酯化；利用气相色谱仪（Agilent 7890B，美国安捷伦科技公司）测定中长链脂肪酸含量；参照Xu等［12］的方法，用毛细管气相色谱－氢火焰离子化检测器（GC-FID）和HP-88脂肪酸甲酯测定专用毛细管柱；用C17：0内标法检测中长链脂肪酸含量，测定条件：载气为高纯He，流量1.1 mL·min－1；氢气流量40 mL·min－1；空气流量450 mL·min－1，分流比20∶1，进样量1.0 μL。进样口温度为250℃，FID检测器温度为250℃；柱箱程序升温：初始温度为150℃，持续5 min，以2℃·min－1的速率升至175℃，持续15 min，再以7℃·min－1的速率升至200℃，持续20 min，最后以5℃·min－1的速率升至220℃，持续25 min；参照Denman等［13］的十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）法提取微生物总DNA，采用高通量实时荧光定量PCR仪（LightCycler 480，美国）测定微生物数量，具体参照Shingfield等［14］的方法。瘤胃液微生物的引物由上海生工生物工程公司合成，具体引物序列见表2。

表2 Real-time PCR引物序列Table 2 Primers sequence of real-time PCR

1.5 统计分析

采用Excel软件整理数据，用SPSS 18.0统计软件进行单因子方差（One-way ANOVA）分析，Duncan法进行多重比较，差异显著性以P＜0.05为判断标准，试验结果以平均值±标准误（mean±SE）表示。

2 结果与分析

2.1 不同剂量硝酸钠对产气参数及瘤胃体外发酵参数的影响

与对照相比，添加硝酸钠显著降低了瘤胃培养液24 h累积总产气量和总甲烷含量（P＜0.05），并随着硝酸钠浓度的增加，甲烷含量显著降低（P＜0.05），1、2和3 mg·mL－1硝酸钠处理，甲烷含量分别降低了68.62%、74.04%、77.31%。添加硝酸钠培养液的pH值、NH3-N含量显著高于对照组（P＜0.05），对MCP含量影响差异不显著（P＞0.05）。添加硝酸钠的异丁酸浓度显著低于对照组（P＜0.05），1、2 mg·mL－1硝酸钠组的异戊酸浓度显著低于对照组和3 mg·mL－1硝酸钠组（P＜0.05），而添加硝酸钠对其他VFA含量和乙酸/丙酸影响差异不显著（P＞0.05）（表3）。

表3 体外发酵24 h后的累积总产气量、总甲烷量、pH值、氨态氮、微生物蛋白和挥发性脂肪酸含量Table 3 The cumulative total gas production，total methane production，pH value，NH3-N，MCP and volatile fatty acid content after 24 h in vitro fermentation

2.2 添加不同剂量硝酸钠对瘤胃液中长链脂肪酸组成的影响

添加3 mg·mL－1硝酸钠组C6：0含量显著高于其他组（P＜0.05）；2、3 mg·mL－1硝酸钠组C10：0含量显著高于其他组（P＜0.05）；3 mg·mL－1硝酸钠组t11-C18：1含量显著高于对照组（P＜0.05）；1 mg·mL－1硝酸钠组C18：2cis-9，trans-11、C18：2trans-10，cis-12含量和UFA/SFA显著高于其他组（P＜0.05）；3 mg·mL－1硝酸钠组C19：0含量显著高于其他组（P＜0.05）；3 mg·mL－1硝酸钠组C21：0含量显著低于对照组和2 mg·mL－1硝酸钠组（P＜0.05）；1 mg·mL－1硝酸钠组C20：5n3（EPA）含量显著高于3 mg·mL－1硝酸钠组（P＜0.05）；2 mg·mL－1硝酸钠组C22：6n3（DHA）含量显著高于其他组（P＜0.05）；2 mg·mL－1硝酸钠组C22：1n9含量显著低于对照组和3 mg·mL－1硝 酸 钠 组（P＜0.05）；2、3 mg·mL－1硝 酸 钠 组C22：2n6、PUFA、UFA含 量 显 著 低 于 其 他 组（P＜0.05）（表4）。

表4 添加不同剂量硝酸钠对体外发酵瘤胃液脂肪酸浓度的影响Table 4 Effect of adding sodium nitrate of different doses on fatty acid concentration of rumen fluid in vitro（μg·mL-1）

2.3 添加不同剂量硝酸钠对瘤胃微生物数量的影响

1 mg·mL－1硝酸钠组瘤胃液的总细菌、真菌、溶纤维丁酸弧菌、蛋白分解丁酸弧菌、非典型丁酸弧菌、亨氏丁酸弧菌数量显著高于其他组（P＜0.05）；2、3 mg·mL－1硝酸钠瘤胃液的产甲烷菌数量显著低于1 mg·mL－1硝酸钠组（P＜0.05）；添加硝酸钠瘤胃液的原虫数量显著低于对照组（P＜0.05）（表5）。

表5 添加不同剂量硝酸钠对瘤胃微生物数量的影响Table 5 Effects of adding sodium nitrate of different doses on the number of rumen microorganisms（copies·mL-1）

3 讨论

瘤胃微生物发酵碳水化合物所产生的乙酸、丙酸和丁酸等挥发性脂肪酸是反刍动物能量的重要来源，其产量及比例可影响反刍动物对营养物质的消化、吸收和利用。硝酸盐类物质在瘤胃内的代谢途径与尿素等非蛋白氮相似，可作为非蛋白氮为反刍动物提供氮源。硝酸盐在瘤胃中先被还原为亚硝酸盐，亚硝酸盐再进一步被转化为氨，此过程消耗氢气，理论上可降低瘤胃甲烷生成量，并且氨和瘤胃中的有机酸作为营养物质能促进瘤胃微生物菌体蛋白的合成。本试验中添加1、2、3 mg·mL－1硝酸钠均显著降低了甲烷产量，与Nguyen等［18］和Sar等［19］硝酸盐抑制甲烷产生的结果一致，表明与甲烷菌CO2-H2的还原途径相比，硝酸根离子较强的氧化性更有利于被氢气还原。瘤胃液pH值和NH3-N含量显著升高，TVFA含量没有显著变化，各培养液pH值（6.71～6.82）均处在正常范围内（5.6～7.5），而稳定的pH值是瘤胃内环境和饲料消化的关键。瘤胃液pH值主要受到TVFA含量和氨浓度的影响，Sar等［19］报道硝酸盐的氨化作用提高了氨浓度，pH值随之升高，本试验也验证了此观点。Zhou等［20］研究发现添加硝酸盐使丙酸浓度和TVFA含量显著下降，乙丙酸比例却随之增加，而本试验结果与之不同，原因可能是硝酸盐的添加量和试验动物有所不同。硝酸盐还原过程所需的氢原子同时来自甲烷和丙酸的生成过程［21］，所以会存在氢原子竞争，硝酸钠还原过程可能对甲烷和乙丙酸的利用具有选择性，该推测有待验证。

不饱和游离脂肪酸在瘤胃内寿命很短暂，会被瘤胃微生物迅速加氢生成饱和产物，此为生物氢化过程。丁酸弧菌属细菌在亚油酸氢化过程中起重要作用，有研究报道［22］，亚油酸将c12-键异构为t11-键生成共轭亚油酸C18：2cis-9，trans－11，再氢化成t11-C18：1，溶纤维丁酸弧菌在这两个过程中起主要作用；而蛋白分解丁酸弧菌和亨氏丁酸弧菌可以实现t11-C18：1氢化为C18：0［23－24］。最后一步氢化过程比之前的步骤慢得多，造成了t11-C18：1在瘤胃中的累积。因此当多种微生物共同作用时，t11-C18：1氢化就成为限速步骤，它控制着整个生物氢化过程的速率。在本试验中添加硝酸钠后t11-C18：1含量显著升高，添加1 mg·mL－1硝酸钠后瘤胃内C18：2cis-9，trans-11、C18：2trans-10，cis-12、UFA/SFA和丁酸弧菌属含量显著升高，表明硝酸钠作为耗氢化合物可以影响亚油酸氢化途径，使t11-C18：1形成增多，促进了CLA的增加，低剂量硝酸钠利于丁酸弧菌的生长和UFA/SFA的提高。这证明溶纤维丁酸弧菌有利于t11-C18：1和CLA的形成，而蛋白分解丁酸弧菌和亨氏丁酸弧菌对t11-C18：1氢化为C18：0的过程没有影响。也有研究者［25］认为丁酸弧菌不影响脂肪酸生物氢化反应的进行。有研究［26］报道在添加α-亚麻酸条件下，1 mg·mL－1硝酸钠在抑制甲烷产生的同时能够降低不饱和脂肪酸的生物氢化程度，提高CLA含量，本试验结果与之相类似。瘤胃微生物的组成、数量和生物氢化过程受到很多因素的影响，各个过程的氢转移机制及相互关联可做进一步探究。

硝酸钠在瘤胃的还原途径以异化还原为主，如果反刍动物在短时间内摄入大量硝酸钠，转化过程中如亚硝酸钠含量不能被及时分解利用，超过了微生物将其转化为氨的能力时，就会对动物机体造成毒害作用，所以必须严格控制使用剂量。有研究［27］表明硝酸钠能降低甲烷产生的主要原因有两个：竞争氢原子和对瘤胃产甲烷微生物的抑制。事实上，原虫也是除产甲烷菌以外产生甲烷的主要来源［28］。硝酸盐通过还原产物亚硝酸盐对包括原虫在内的瘤胃微生物产生毒害作用，从而抑制原虫［29］。在本试验中添加硝酸钠后甲烷产量和原虫数量显著降低，产甲烷菌数量在添加2、3 mg·mL－1硝酸钠水平下显著降低，非典型丁酸弧菌和亨氏丁酸弧菌数量在3 mg·mL－1硝酸钠水平下显著降低，也证实了硝酸钠可以通过抑制产甲烷微生物来降低甲烷产量，并且高剂量硝酸钠可能对瘤胃微生物产生了不利影响。孙雨坤［30］从肉羊体外试验得出随着硝酸盐浓度的增加，原虫数量减少，甲烷浓度也随之降低，本试验结果与之相似。添加1 mg·mL－1硝酸钠后瘤胃总细菌、真菌及丁酸弧菌属细菌数量显著高于对照组，可以看出低剂量硝酸钠可以促进瘤胃大多微生物的增加。硝酸盐有降低甲烷排放和抑制亚油酸氢化的潜力，但需要结合更多的体内试验总结出硝酸盐的适宜添加量。

4 结论

体外添加0.25 mg·mL－1亚油酸条件下，1～3 mg·mL－1硝酸钠均能抑制水牛瘤胃甲烷产生，并不影响TVFA含量。并且1 mg·mL－1硝酸钠能促进亚油酸生成CLA，升高EPA含量和UFA/SFA，优化脂肪酸组成，并能增加总细菌、真菌、丁酸弧菌等大多数瘤胃微生物的数量。