王丽，赵欣，马静，成志平△，宝山，那松巴乙拉

（1包头市食品药品检验检测中心，内蒙古 包头；2内蒙古自治区国际蒙医医院，内蒙古 呼和浩特）

0 引言

黏-7丸由草乌叶、诃子、茜草、多叶棘豆、没药、麝香、闹样花7味药材组成，茜草是其中的主要药味之一。黏-7丸主要功能为清瘟解毒、消“粘”、止痛、散瘀、止痢。用于瘟疫盛热、脑膜炎、赤白痢疾、白喉、音哑、甲性肝炎、胸刺痛、转筋[1-3]。文献考证及历版标准收载，“黏-7丸”处方来源于《医疗手册》（内蒙古人民出版社1973年蒙文版第1281页）。最早收载本方的法定标准为《内蒙古蒙成药标准》1984年版第336页收载，该品种项下仅有性状及丸剂的通项检查，无其主要成分大叶茜草素含量的测定，所以有必要对其质量标准进行完善，以全面有效地控制药材质量[4-6]。

1 仪器与试药

1.1 主要仪器

岛津LC-20AT高效液相色谱仪；色谱柱:Phenomen C18 ：4.6mm×250mm，5μm；Diamonsil C18：250mm×4.6mm，5μm；Sartorius BP 211D十万分之一电子分析天平；Sartorius AL 204-IC万分之一电子分析天平；KQ-500DE数控超声清洗器。

1.2 试剂与试药

大叶茜草素对照品（110884-200604），购自中国食品药品检定研究院。甲醇为色谱纯（Fisher Scientific），水为超纯水；黏-7丸为由内蒙古国际蒙医医院提供，批号20200301，20200305，20200423。规格：2g/10丸。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性实验

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水（85∶15）为流动相；检测波长为250nm；柱温30℃。理论板数按大叶茜草素峰计算应不低于5000。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液的制备

取大叶茜草素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含50μg的溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备

取本品适量，研细，取约4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇100ml，密塞，称定重量，放置5-8h，超声处理（功率250W，频率40kHz）30min，放冷再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液50ml，蒸干，残渣加甲醇-25%盐酸（4∶1）混合溶液20ml溶解，置水浴中加热水解30min，立即冷却，加入三乙胺3ml，混匀，转移至25ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 测定法

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

2.4 专属性考察

按供试品溶液的制备方法制备阴性对照溶液（缺茜草），按确定的色谱条件分别精密吸取供试品溶液、阴性对照溶液、大叶茜草素对照品溶液各20μl，注入液相色谱仪。阴性样品对大叶茜草素的测定没有干扰。

2.5 线性范围

取精密称取大叶茜草素对照品，用甲醇溶解并制成每1ml含有大叶茜草素116.5μg的溶液，作为对照品溶液。吸取该对照品溶液1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml、10ml，分别至7个10ml量瓶中，分别用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。以上系列溶液的浓度分别为11.65、23.30、34.95、46.60、58.25、69.90、116.5μg/ml。吸取以上的系列溶液各20µl，分别注入液相色谱仪中，按上述色谱条件测定，记录各图谱的大叶茜草素峰面积积分值（Y）。以进样量（X：μg）对峰面积积分值（Y）进行回归分析。结果显示，大叶茜草素在0.233-2.33μg范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系，回归方程为Y=6300.6X-267.53（R2=0.9978）。

2.6 精密度

取大叶茜草素对照品（浓度56.8μg/ml），连续进样6次。其RSD为0.95% (n=6)，表明仪器的精密度良好。

2.7 重复性

取同一批号供试品（批号20200301）6份，各约4.0g，精密称定，分别按上述供试品溶液的制备和色谱条件进行测定，在250nm波长处测定峰面积，按外标峰面积计算。测定每份样品的含量，进样量各20μl，计算得RSD为2.00% (n=6)，表明该方法重复性良好。

2.8 稳定性

取同一份供试品（批号20200301）溶液，按上述色谱条件，分别在0h、0.5h、1h、2h、4h、6h、8h、24h进行测定，记录峰面积。24h的RSD 为0.89% (n=6)。从数据中可见，大叶茜草素在24h内的面积积分值基本稳定不变。

2.9 准确度

取含量已知的黏-7丸样品（内蒙古内蒙古国际蒙医医院提供，批号为20200301，含量为0.800mg/g），研细，精密称取约2g，取3份，每份加入一定量大叶茜草素对照品，与供试品含有量的比值约为80%；同法再称取3份样品，每份加入一定量大叶茜草素对照品，与供试品含有量的比值约为100%；同法再称取3份样品，每份加入一定量大叶茜草素对照品，与供试品含有量的比值约为120%。制备供试品溶液，按上述色谱条件进行操作，进样体积为20μl。结果显示，80%、100%、120%的回收试验结果的均值为99.3%，平均的RSD为1.94%。方法的准确度好。

2.10 耐用性试验

换不同厂家、不同型号的色谱柱，取样品（20200301），精密称定，按供试品制备方法制备样品，在250nm波长处测定峰面积，按外标峰面积计算，测定含量，结果见表1。结果显示，Phenomenex C18柱的峰窄而高，Diamonsil C18柱的峰宽且矮，两个柱子均能达到与相邻峰的基线分离，按大叶茜草素的峰计算理论塔板数均大于10000，两个柱子的含量测定结果基本一致。故实验对柱子的型号不做要求。

表1 不同色谱柱的试验结果

2.11 样品测定

依据建立的大叶茜草素含量测定方法，对3批次黏-7丸中的大叶茜草素含量进行考察，其大叶茜草素含量分别为3.84 mg/g、2.24 mg/g、2.23mg/g。

3 讨论

3.1 流动相的选择

按《中国药典》2015年版中“茜草”项下方法制备供试品溶液，对以下三种流动相进行了比较研究：甲醇-乙腈-0.2%磷酸溶液（25:50:25）、甲醇-乙腈-水（6：3:1）和甲醇-水（85:15）。结果表明，以甲醇-水（85：15）作为流动相时，保留时间适中，且分离效果好。

3.2 检测波长的选择

在200-800nm范围内对大叶茜草素进行光谱扫描，结果显示，大叶茜草素在218.00nm、246.50nm、273.00nm、281.50nm、392.00nm处有吸收。将黏-7丸供试品溶液和大叶茜草素对照品溶液分别注入高效液相色谱仪，对紫外检测器设定不同检测波长的情况下，对大叶茜草素峰进行检测，并计算黏-7丸中大叶茜草素的含量。结果表明在250nm波长处，大叶茜草素含量最高，故确定250nm作为检测波长，与《中国药典》2015年版一部茜草项下的检测波长一致[7]。

3.3 提取方法的选择

分别采用不同的提取方法超声（先浸泡过夜）、回流（先浸泡过夜）、索氏提取，制备供试品溶液，按照《中国药典》2015年版中茜草的含量测定方法测定大叶茜草素的含量，三组试验结果显示，甲醇超声的提取效率高，且操作简便，故选用甲醇超声提取的方法，其方法与《中国药典》2015年版一部的茜草项下的方法相同。

3.4 提取溶剂的选择

在HPLC法测定茜草中大叶茜草素的含量时，《中国药典》2015年版一部采用的提取溶剂是甲醇。为比较不同极性溶剂对大叶茜草素含量的影响，对不同的提取溶剂甲醇、乙醇、80%乙醇进行了比较研究，结果显示，用甲醇作为提取溶剂时的提取效率最高，故确定甲醇为提取溶剂。

3.5 提取时间的选择

分别选取提取时间为15min、30min、45min、60min进行试验，结果显示，从15-30min，随着提取时间的延长，提取效率增加；30min以后，提取时间的延长使含量有下降趋势。故将超声时间确定为30min。

3.6 浸泡时间的选择

针对《中国药典》2015年一部版茜草含量测定项下的浸泡时间，设置了不同的浸泡时间1h、3h、5h、8h、12h、18h，对浸泡时间对测定结果的影响进行了考察，结果显示浸泡时间在0-5h范围内，随浸泡时间增加，大叶茜草素含量逐渐增大；浸泡5-8h之间，大叶茜草素含量稳定；浸泡时间大于8h时，大叶茜草素含量有下降趋势，可能的原因是大叶茜草素在甲醇溶液中不稳定[8]。故浸泡时间以5-8h为宜。

综上所述，本文建立了黏-7丸蒙药制剂中大叶茜草素含量的高效液相色谱测定法，该方法科学、简便、专属性较强，为促进蒙药标准化、提高蒙药发展水平具有一定的积极意义。