赵欣，王丽，马静，成志平△，宝山，那松巴乙拉

（1包头市食品药品检验检测中心，内蒙古 包头；2内蒙古自治区国际蒙医医院，内蒙古 呼和浩特）

0 引言

别木图-9丸具有清肝热功能，用于受损性肝热，肝血热盛，黄疸，肝“宝日”病，“宝日巴达干”病。红花是一种可活血化瘀、散瘀止痛的药物，是一种菊科植物，其拉丁学名为Carthamus tinctorius L.[1]。该种药物中含有一种羟基红花黄色素A的物质，其可通过激活BKCa通道，从而起到抑制L型Ca通道的作用，以此诱导机体发生血管舒张[2]；而且还可以有效治疗机体的心肌缺血再灌注损伤、缺血性脑灌注等，有研究指出其机理可能与其抑制JAK2/STAT1通路有关，而且该种物质还是活血化瘀的主要有效成分[3,4]。除此之外，也具有抗炎、抗氧化等作用，有研究发现，其可通过对MAPK、TNFR1/NF-κB等信号通路进行有效地抑制，从而发挥降低细胞炎性反应因子水平的作用[5-7]，是红花发挥药效的重要成分。故建立合理有效的测定方法对其质量进行控制具有一定的现实意义。本研究中采用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）测定别木图-9丸红花中红花羟基黄色素A的含量。

1 仪器与试药

1.1 主要仪器

岛津LC-20AT高效液相色谱仪（日本岛津公司）；色谱柱：岛津C18柱（250×4.6mm 5μm）、Phenomenex C18柱（250mm×4.6mm 5μm）；Thermo Accliam C18：250mm×4.6mm，5μm（美 国Thermo公 司）；Sartorius BP 211D十万分之一电子分析天平（德国赛多利斯公司）；Sartorius AL 204-IC 万分之一电子分析天平（德国赛多利斯公司）；KQ-500DE数控超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试剂与试药

羟基红花黄色素A对照品（111637-201810），纯度：93.1%，购自中国食品药品检定研究院。乙腈、甲醇为色谱纯（Fisher Scientific），水为超纯水；别木图-9丸为内蒙古自治区国际蒙医医院蒙药制剂中心生产，批号分别为20190932、20190927、20191216，规格：2g/10丸。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性实验

本研究中的填充剂选用十八烷基硅烷键合硅胶，其流动相为甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液（26∶2∶72）；流速、检测波长、柱温分别为1ml/min、403nm、30℃。根据羟基红花黄色素A峰来计算其理论板数，其应不低于5000。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液的制备

准确称量并测定适量羟基红花黄色素A作为对照品，加入25%甲醇，制备含0.05mg/ml的溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备

取本品适量，研细，取约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，准确称量并吸取25%甲醇50ml加入，密塞后称定重量，超声处理（功率300 W，频率40 kHz）30 min，取出，放冷，并再次称量，用25%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 测定法

准确称量并吸取对照品10μl、供试品10μl，分别注入液相色谱仪进行测定。

2.4 专属性考察

按本品处方方法制备不含红花的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备不含红花的阴性对照溶液（缺红花），按上述色谱条件进行实验，结果显示，阴性样品不会对羟基红花黄色素A的测定产生干扰。

2.5 线性范围

准确称量2.48mg的羟基红花黄色素A对照品，放入50ml容量瓶中，加25%甲醇使其溶解，稀释至刻度处，摇晃并使其均匀，作为对照品溶液。准确称量并分别吸取1、3、5、10、15、20μl，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，以峰面积对进样量进行回归分析，回归方程：羟基红花黄色素A：Y=3396871.7X-25821.89（R2=0.9998)。结果表明羟基红花黄色素A在0.0497-0.994ng范围内分别呈良好的线性关系。

2.6 重复性

准确称量后 取6份（2g/份）同一批号（批 号：20190932）的供试品，分别按上述供试品溶液的制备和色谱条件进行测定，照高效液相色谱法（《中国药典》2015年版四部通则0512），在403nm波长处测定峰面积，按外标峰面积计算。测定每份样品的含量。进样量各10μl。其RSD为1.44% (n=6)，表明该方法重复性良好。

2.7 稳定性

取同一份供试品（批号20190932）溶液，按上述色谱条件，分别在0h、2h、4h、12h、24h进行测定，记录峰面积。24h的RSD 为0.04% (n=6)。从数据中可见，羟基红花黄色素A在24h内的面积积分值基本稳定不变。

2.8 准确度

加样回收率实验：准确称量后取6份（1g/份）同一批号（批号：20190932）的供试品，置具塞锥形瓶中，分别加入对照品溶液50ml（其中羟基红花黄色素A浓度为0.029mg/ml），按2.2.2及2.1进行测定，准确记录色谱图，并对回收率进行计算，平均回收率为98.95%，其RSD为0.74%。

2.9 耐用性试验

结果见表1。

表1 不同色谱柱的耐用试验

2.10 样品测定

依据建立的羟基红花黄色素A含量测定方法，对3批次别木图-9丸中的羟基红花黄色素A含量进行考察，其羟基红花黄色素A含量分别为1.44、1.81、1.74mg/g。

3 讨论

3.1 溶剂

参照《中国药典》（2015年版），其中使用甲醇作为提取溶剂，同时与25%甲醇作溶剂进行提取效率考察，结果25%甲醇作溶剂，测得含量高于甲醇提出量，且干扰成分少，由于试验样品的分离效果良好，所以确定了25%甲醇作为提取溶媒。

3.2 提取

《中国药典》（2015年版）中“红花”的超声提取方法比较成熟，因此选择超声波提取，时间为30min。

3.3 流动相

根据《中国药典》（2015年版），采用甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液（26：2：72）作为流动相，结果分离效果好、保留时间适中，故确定为甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液（26：2：72）为流动相。

3.4 柱温

在实验中，笔者比较了30℃和40℃的柱温，虽然保持时间略有不同，但是分离度和理论板数没有变化，因此本研究使用了30℃的柱温。

3.5 波长

本研究使用二极管阵列检测器扫描了200-800nm范围内的羟基红花黄色素A的光谱。结果表明，羟基红花黄色素A在401nm处具有吸收峰。根据《中国药典》（2015年版）中红花的含量测定方法，选择403nm作为检测波长。

按原处方比例，本实验室自制的别木图-9丸模拟样每g含有羟基红花黄色素A2.535-0.063mg/50ml，以模拟样药材为原料制成的批号为20190932的别木图-9丸中羟基红花黄色素A含量为1.663mg/g，转移率为77.33 %。《中国药典》2015年版一部要求红花中羟基红花黄色素A的含量不得低于1.00%，按此含量、处方量及转移率计算，别木图-9丸中应含有羟基红花黄色素A1.286 mg/g。参考以上测定结果、回收率、生产工艺及批间差异，拟规定别木图-9丸红花中羟基红花黄色素A（C27H32O16）计，不得少于0.90 mg/g。

综上所述，本文建立了蒙药别木图-9丸红花中羟基红花黄色素A的含量测定方法，该方法科学、简便、专属性较强，为促进蒙药标准化、提高蒙药发展水平具有一定的积极意义[8]。