李志红 黄书娟 王宁 崔茂香

【摘 要】常规病理石蜡切片制作技术，是病理技术中一项最基本、最常用的技术方法，广泛应用于临床病理诊断、教学及科研工作中。根据小鼠甲状腺组织特点，探索其常规病理石蜡切片制作方案，依据病理切片制作过程中常出现的质量问题做出总结，提出相应的预防和处理方法，以提高常规病理石蜡切片质量。

【关键词】小鼠；甲状腺；石蜡切片

甲状腺是人和动物体内重要的内分泌器官，全身及自身功能的改变均可引起甲状腺组织形态结构的改变，因此甲状腺疾病的种类繁多。在科学研究中，常运用小鼠制备甲状腺疾病及治疗模型，常规石蜡切片的质量直接影响到对疾病诊断及治疗效果的判断。小鼠甲状腺组织较人体甲状腺组织水分含量多，体积小且稚嫩、柔软，根据其结构特点[1]，选择适合的制片方案，以做出高质量的石蜡切片。常规石蜡切片制作历经取材、固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、贴片、烤片、染色、封固十一个步骤，现将小鼠甲状腺组织石蜡切片制作体会介绍如下。

1 材料与方法

1.1材料

实验动物均选用健康balb/c小鼠，体重16g～24g，平均体重（20±2）g；10%中性甲醛缓冲溶液、常规病理制片与HE染色试剂。

1.2 方法

1.2.1 取材与固定 沿小鼠颈正中线剪开皮肤，分离皮下组织，暴露甲状软骨和气管，从软骨下插入一眼科镊，将甲状软骨和气管撑开、挑起，用眼科剪剪断甲状软骨和部分气管，在甲状软骨向气管过渡的两侧缘剥离甲状腺组织[2]，入10%中性甲醛缓冲溶液中固定。

1.2.2 脱水与透明 将固定后的组织脱水透明，具体程序：60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ脱水各30min～60min，其中95%乙醇可过夜；无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ脱水各10min～15min，二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ透明各3min～10min。

1.2.3 浸蜡与包埋 透明后用熔点为56℃～58℃石蜡浸蜡，浸蜡温度设定在58℃左右，石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ、石蜡Ⅲ浸蜡时间各5min～10min，包埋蜡温62℃～64℃。

1.2.4切片、贴片与烤片 切片厚度4um～5um，展片水温42℃～48℃，烤片温度60℃～65℃，烤片时间30min～60min。

1.2.5染色与封固 共七步。脱蜡：三步二甲苯共15min～30min；脱苯至水：二步无水乙醇共10min～15min、95%乙醇3min、85%乙醇3min、70%乙醇3min、水洗1min～2min；苏木素染色：Harris苏木素染液5min～10min、水冲洗10s～30s；分化返蓝：1%盐酸乙醇分化5s、自来水冲洗15min～30min；伊红染色：伊红染液1min～2min、水分化30s；脱水透明：85%乙醇30s、二步95%乙醇共2min～5min、二步无水乙醇共5min～10min；封固：中性树胶封片。

2 结果

切片平坦、厚薄均匀，染色细胞浆与细胞核红蓝相映，对比明显，结构清晰。

3 讨论

小鼠甲状腺组织石蜡切片制作存在一定困难，在操作时需要注意每一个环节。

3.1取材与固定

小鼠甲状腺体积小，颜色与周围组织相近，不易辨认，取材时可用针头挑取后及时固定[2]。10%中性甲醛缓冲溶液固定的标本在脱水前适当水冲洗。

3.2 脱水与透明

脱水需要彻底，组织从低浓度逐级至高浓度乙醇置换其内水分，至无水乙醇时要控制时间，防止组织脱水不足或过量；透明宜适当，避免组织变脆；不同级别乙醇及二甲苯浓度要保持稳定。

3.3 浸蜡与包埋

温度和时间是浸蜡的关键问题，浸蜡温度一般设定在所选石蜡熔点上线，温度过高或时间过长，甲状腺组织可出现收缩、变脆，温度过低或时间过短，石蜡在甲状腺组织块中将得不到充分的饱和，切片均会出现困难；组织包埋时，包埋石蜡的温度要比浸蜡石蜡温度高4℃～6℃，取出组织包埋时操作要迅速，防止组织与包埋石蜡融合不良，导致分离。

3.4 切片、贴片与烤片

切片前要将切片机上有关的螺旋拧紧，防止跳刀现象发生；一次性切片刀要选用新刀口，刀架角度要适宜，手工切片用力要均匀、一致，要轻柔、慢切[3]，必要时对蜡面进行湿化，防止切片出现颤痕[4]；切出的蜡片可先在常温水中进行粗展，然后再放入42℃～48℃水中进行细致展片，可适当增加展片时间；贴片时玻片要保证其洁净度，防止切片粘贴不牢。

3.5 染色与封固

脱蜡、脱苯、脱水、透明要彻底，脱蜡时间宁长勿短；梯度乙醇水化要充分；保持染液的清洁，应经常过滤或更换；分化要适度，若切片分化不足，组织着色过深使细胞核浆的分界不清楚，若分化过度，细胞核浆染色过淡不清晰；水洗要合理，苏木素染色后水洗时间不宜长，而盐酸酒精分化后水洗时间不宜短；染色过程中防止切片干涸，避免形成“龟裂”或细胞核出现透明不良；封固时，切片上应保留适当的二甲苯濕封，避免干封产生气泡[5]。

总之，影响小鼠常规石蜡切片制作的因素是多方面的，许多因素与结果关联重叠。欲制作优质的小鼠甲状腺组织常规石蜡切片，需掌握小鼠甲状腺组织结构特点，不断探索不同条件下切片制作的最适宜方案，科学处理，精益求精，以获得良好制片的效果。

参考文献

[1] 高宝红.介绍大鼠各组织器官石蜡切片制作法[J].实用医技杂志，2009，16（12）：1023-1024.

[2] 卢文丽，潘志强，方肇勤，等.大？小鼠甲状腺和甲状旁腺的解剖[J].实验动物与比较医学，2009，29（5）：310-312.

[3] 郑伟，刘亚军，陈倩倩.两种改良脱水程序在小白鼠不同组织处理中的应用比较[J].临床与实验病理学杂志，2016，32（8）：940-941.

[4] 薛晓伟，李星奇，王德田，等.探讨减少甲状腺滤泡中胶质引起石蜡切片皱缩的方法[J].诊断病理学杂志，2014，21（3）：192.

[5] 罗灿峤，莫木琼，钟觉民，等.病理HE切片常见的质量问题及处理方法[J].中国实用医药，2010，5（1）：39-40.