张瑜 李欠 黄翔 冯彦梅 杨兰 邱黛玉

摘 要： 為优化中药材当归中主要活性成分阿魏酸和藁本内酯同时提取的最佳工艺条件，该文以超声波辅助响应面优化当归中阿魏酸和藁本内酯提取工艺，采用氢核磁共振定量方法同时测定当归中阿魏酸和藁本内酯的含量。优化工艺以阿魏酸和藁本内酯含量的综合评分为考察指标，选取乙醇浓度、提取时间、液料比三个主要因素，采用单因素筛选结合Box-Behnken中心组合设计试验优化提取工艺参数。结果表明：优化的最佳提取工艺条件为乙醇浓度80.87%，液料比13.04 mL·g-1，提取时间30.14 min，验证试验结果与预测值一致。氢核磁共振定量方法以氘代二甲基亚砜为测试溶剂，吡嗪为内标物，其中吡嗪、阿魏酸和藁本内酯的定量共振峰分别为δ 8.66 ppm、δ 6.37～6.35 ppm和δ 5.55～5.53 ppm。该方法的精密度、稳定性、重复性和加标回收率良好，定量限和检测限较低，能够满足实际分析测试需要。综上所述，利用响应面法对提取工艺条进行优化，实验结果准确可靠，重现性良好，适用于当归中阿魏酸和藁本内酯的同时提取;氢核磁共振定量方法操作简单、分析速度快、专属性强，可用于当归中阿魏酸和藁本内酯的同时测定。

关键词： 提取工艺， 当归， Box-Behnken响应面法， 氢核磁共振

中图分类号： Q946  文献标识码： A  文章编号： 1000-3142（2021）07-1188-08

Abstract： In order to optimize the optimum technological conditions for the simultaneous extraction of ferulic acid and ligustilide， the extraction process of ferulic acid and ligustilide from A. sinensis were optimized by ultrasonic assisted response surface. Taking the comprehensive score of ferulic acid and ligustilide content as the evaluation index and the ethanol concentration， extraction time and liquid-to-solid ratio were selected as the three main factors， and the contents of ferulic acid and ligustilide in A. sinensis were determined by 1H-qNMR. Single factor screening combined with Box-Behnken central combination design test was used to optimize the parameters of extraction process. The single-factor screening results showed that a high comprehensive score was obtained under the three conditions of 80% ethanol concentration， liquid-to-solid ratio was 12 mL·g-1， or 30 min extraction duration. Based on this， the Behnken center combination design test was designed and implemented. The results showed that the influence degree of each experimental factor on the comprehensive score was the ethanol concentration， the liquid-to-solid ratio was the second， and the extraction time was the least. The best optimum extraction conditions were as follows： ethanol concentration was 80.87%， liquid-to-solid ratio was 13.04 mL·g-1， extraction duration was 30.14 min. The verification test results were consistent with the predicted values. The quantitative resonance peaks of pyrazine， ferulic acid and ligustilide were δ 8.66 ppm， δ 6.37-6.35 ppm and δ 5.55-5.53 ppm， respectively， using DMSO-d6 as solvent and pyrazine as internal standard substance by 1H-qNMR. The precision， stability， repeatability and recovery of the method were good， and the limits of quantification and detection were low， which can meet the needs of practical analysis and testing. To sum up， the optimization method of response surface method was used to optimize the extraction process， the experimental results were accurate and reliable， good reproducibility， and suitable for the simultaneous extraction of ferulic acid and ligustilide in A. sinensis. The 1H-qNMR method had the advantages of simple operation， fast analysis speed and strong specificity， and could be used for the simultaneous determination of ferulic acid and ligustilide in A. sinensis.

Key words： extraction process， Angelica sinensis， Box-Behnken response surface method， 1H-qNMR

中药材当归是伞形科当归属植物当归（Angelica sinensis）的干燥根（国家药典委员会，2015），具有补血活血、调经止痛、润肠通便的作用，是我国临床最常用中药之一（国家药典委员会，2015;董晴和陈明苍，2016）。当归中主要含有的生物活性成分有挥发油、有机酸类、多糖以及黄酮等（周桂生等，2012;趙雪娇等，2013）。其中，阿魏酸是当归中有机酸类的代表，属于较早分离出来的有效成分之一（赵雪娇等，2013）。挥发油在当归中含量约为1%，是当归的重要有效成分之一，其中以藁本内酯含量为最高。2015年版《中国药典》以阿魏酸的含量测定和其他常规鉴别项目作为当归质量控制的手段和指标（国家药典委员会，2015），而对藁本内酯含量并未作出明确规定。

近年来，响应面法和氢核磁定量方法分别在中药有效成分的提取和含量测定方面得以广泛应用（Xu et al.，2013;林珊等，2014;王志伟等，2016;赵昱玮等，2016;高伟等，2017;Tanaka et al.，2019;户宪珍等，2019;黄翔等，2019;Sun et al.，2017;王红等，2019;周吉等，2019）。氢核磁定量方法测试时间非常短（2～5 min即可完成），特征峰化学位移在不同仪器之间重现性好，且定量过程中不需使用对照品，通过廉价易得的内标物即可完成定量，可以有效降低成本（林珊等，2014;王志伟等，2016;高伟等，2017;Tanaka et al.，2017）。响应面优化提取方法与常用的正交实验法相比具有很多优点：响应面法的实验次数相对较少，检测精确度高，预测的函数模型相对准确，因其能够准确地反映实验因素和预测结果之间关系而得以广泛应用（Xu et al.，2013;赵昱玮，2016;Sun et al.，2017; 户宪珍等，2019;黄翔等，2019;王红等，2019;周吉等，2019）。本文以阿魏酸和藁本内酯成分含量的综合评分为响应值，使用Design-Expert 10.0.4.0软件进行试验设计，优化当归提取工艺，为当归应用和质量标准建立提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

对照品阿魏酸（批号：FD170255）购自萨恩化学技术有限公司;藁本内酯购自北京库来搏科技有限公司，纯度>98%;吡嗪购自上海麦克林生化科技有限公司;DMSO-d6（氘代纯度，99.9%）购自萨恩化学技术有限公司。当归药材购自甘肃岷县经甘肃农业大学中药学教研室邱黛玉副教授鉴定为中药当归。

核磁共振波谱仪（Bruker Advance Ⅲ 600），AL-104电子分析天平（慈溪市天东衡器厂）、KQ-500B超声波清洗仪（深圳市得康科技有限公司）、旋转蒸发仪R-101N（郑州长城科工贸有限公司）、恒温水浴锅（江苏正基有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 氢核磁共振测试条件 DMSO-d6为测试溶剂，吡嗪为内标物。吡嗪、阿魏酸和藁本内酯的定量共振峰分别为δ 8.66、δ 6.37～6.35 ppm、δ 5.55～5.53 ppm。

采用zg30脉冲序列，谱宽（SWH）为11 904.8 Hz，弛豫时间（D1）为1 s，脉冲宽度（P1） 14.90 s，样品扫描次数（NS） 32次。所有数据均使用MestReNova软件处理。

1.2.2 溶液的制备 内标溶液的制备：准确称取19.70 mg内标物吡嗪溶解至3.94 mL DMSO-d6中，制得5.00 mg·mL-1内标溶液，作为用于1H-qNMR样品定量的内标样品;准确称取7.50 mg内标物吡嗪溶解至0.75 mL DMSO-d6中，制得10.00 mg·mL-1内标溶液，作为用于线性关系考察时1H-qNMR定量的内标样品。

对照品溶液的制备：准确称取22.00 mg阿魏酸对照品溶解至2 mL DMSO-d6溶液中，制得11.00 mg·mL-1阿魏酸对照品溶液;准确称取59.00 mg藁本内酯对照品溶解至2 mL DMSO-d6溶液中，制得29.50 mg·mL-1藁本内酯对照品溶液备用。

当归提取物的制备：取药材粉末（过40目筛）约10.00 g，精密称定，置于容量瓶中，加入90%乙醇100 mL，超声处理（40 min，40 ℃），抽滤，重复2次，合并滤液，于50 ℃减压回收溶剂至无醇味，用2倍量乙酸乙酯萃取2次，合并乙酸乙酯，于70 ℃ 水浴上旋干得粗浸膏并称重。

供试品溶液的制备：取上述浸膏20 mg，精密称定，加内标溶液吡嗪50 μL（吡嗪19.70 mg，溶于3.94 mL DMSO-d6），再加入450 μL DMSO-d6，超声溶解，移置核磁管，用于氢核磁共振法测定（图1）。

1.2.3 方法学考察

1.2.3.1 线性关系考察 取“1.2.2”项下对照品储备液400、200、100、50、25和13 μL装入核磁管，加入内标溶液吡嗪50 μL（吡嗪7.5 mg，溶于0.75 mL DMSO-d6），再依次加入DMSO-d6 50、250、350、400、425、437 μL，即得8.80、4.40、2.20、1.10、0.550、0.286 mg·mL-1阿魏酸对照品溶液和23.6、11.8、5.90、2.95、1.48、0.767 mg·mL-1藁本内酯对照品溶液系，进行1H-NMR测定。

1.2.3.2 精密度考察 取“1.2.2”项下对照品溶液，按“1.2.1”项下核磁条件，重复测定5次，以对照品定量峰面积与内标物定量峰面积的比值计算阿魏酸和藁本内酯的RSD值。

1.2.3.3 重复性试验 平行制备6份供试品溶液，在同一实验条件下测定，以样品定量峰面积与内标物定量峰面积的比值计算阿魏酸和藁本内酯的RSD值。

1.2.3.4 稳定性试验 将供试品溶液在室温下放置，时间分别为0、2、4、8、10、12、24 h，然后进行稳定性实验测定，以样品定量峰与内标物定量峰面积比值计算阿魏酸和藁本内酯的RSD值。

1.2.3.5 加样回收率试验 制备5份已知含量的当归药材样品浸膏供试液，分别加入藁本内酯和阿魏酸对照品DMSO-d6溶液，按照“1.2.1”项下的條件测定，计算回收率和RSD值。

1.2.4 检出限和定量限 1H-qNMR检出限（LOD）和定量限（LOQ）可由LOD=3.3 σ/S，LOQ=10 σ/S计算得出（σ指回归线的剩余标准差，S指非零截距线性回归曲线斜率）。

1.2.5 样品含量测定 按“1.2.2”项下“供试品溶液制备”方法平行制备试验样品溶液2份，并按照“1.2.1”项核磁共振测试条件下进行重复测定2次，计算样品的含量平均值。

1.2.6 数据标准化处理 按照标准化处理公式，将单因素试验结果和响应面试验的结果进行数据标准化处理，最终得到2种指标成分的综合评分。

1.2.7 单因素试验设计 以藁本内酯和阿魏酸2种成分提取含量作为综合评分的考察指标，分别考察提取溶剂乙醇浓度、提取时间和液料比三个因素对藁本内酯和阿魏酸提取率的影响。

1.2.8 响应面试验设计 以上述优化后的各单因素值为基础，通过Design-Expert 10.0.4.0软件Box-Behnken响应面设计，对乙醇浓度、液料比、提取时间3个因素结果进一步优化，重复试验，并进行分析。

2 结果与分析

2.1 方法学考察

2.1.1 线性关系考察 分别以对照品的积分面积X与对照品溶液浓度Y做线性回归，得出回归方程分别为阿魏酸Y=7.007X+0.016，R2=0.999，线性范围0.286～8.80 mg·mL-1;藁本内酯Y=7.223X+0.211，R2=0.999，线性范围0.767～23.6 mg·mL-1。A. 吡嗪; B. 阿魏酸对照品; C. 藁本内酯对照品; D. 当归提取物; 1. 阿魏酸定量峰; 2. 藁本内酯定量峰; δ=8.66为内标物吡嗪定量峰。

2.1.2 精密度考察 以对照品定量峰面积与内标物定量峰面积的比值计算阿魏酸和藁本内酯的RSD值分别为1.41%、0.34%。表明仪器精密度良好。

2.1.3 重复性试验 以样品定量峰面积与内标物定量峰面积的比值计算阿魏酸和藁本内酯的RSD值分别为1.50%、1.54%，表明该方法具有良好的重复性。

2.1.4 稳定性试验 以样品定量峰与内标物定量峰面积比值计算阿魏酸和藁本内酯的RSD值分别为2.21%、1.62%，表明供试品溶液24 h稳定。

2.1.5 加样回收率试验 阿魏酸和藁本内酯的回收率分别为95.2%～102.3% （ RSD=2.91% ）和97.7%～103.7% （RSD=2.41% ），平均回收率分别为98.6%和100.24%，加样回收率良好。

2.2 检出限和定量限

计算得出：阿魏酸LOD=21.11 μg·mL-1，LOQ=63.97 μg·mL-1;藁本内酯LOD=58.76 μg·mL-1，LOQ=178.07 μg·mL-1。

2.3 单因素实验结果

表1为单因素试验设计方案，平行提取3次。表2为数据标准化处理结果。从表2可以看出，综合评分随着乙醇体积分数的增大先上升随后开始降低。当乙醇体积分数为80%左右时，综合评分达到最高值，表明此时阿魏酸和藁本内酯溶解度最大，因此选择80%乙醇体积分数作为最优选择。液料比在大于12 mL·g-1后，综合评分变化趋于平缓，表明溶剂中阿魏酸和藁本内酯含量趋于平稳，最佳液料比为12 mL·g-1时即可溶出大部分有效成分。综合评分在10～30 min时逐渐增大，30 min左右趋于稳定，40 min以后综合评分有少许下降，因此30 min为最优超声时间。

2.4 响应面实验结果

2.4.1 响应面实验设计方案 以乙醇浓度（A）、液料比（B）、提取时间（C）作为该响应面实验设计的三个自变量，以阿魏酸和藁本内酯含量的综合评分作为响应值（R），采用Box-Behnken方法进行实验设计，实验设计方案和结果见表3。

2.4.2 模型显著性分析 本研究采用Design-Expert 10.0.4.0软件对表3中数据进行处理，经拟合得到回归方程为R=2.09+0.47 A+0.13 B+0.19 C-0.12 AB+0.44 AC-0.38 BC-3.29 A2-0.73 B2-0.43 C2，调整系数为0.992 7，决定系数（r2）=0.996 8，表明回归方程拟合度好，实验误差小，此模型可用于该实验的分析。

表4为方差分析和显著性检验结果，结果说明乙醇浓度、液料比、提取时间和乙醇浓度与液料比、提取时间与液料比的交互作用对综合评分有显著的影响。各实验因素对综合评分影响顺序为乙醇浓度（A）>液料比（C）>提取时间（B）。

2.4.3 最佳提取工艺参数预测及实验验证 通过图2可知，乙醇浓度与液料比、 乙醇浓度与提取时间的3D曲面图的倾斜度较高，说明因素间交互作用显著，对当归中两种有效成分提取的影响较显著。以阿魏酸和藁本内酯两种成分评分最大值为目标，由软件分析，得出这两种指标成分的最佳提取条件为乙醇浓度80.87%，液料比13.04 mL·g-1，提取时间30.14 min。为了方便实际操作，将提取条件参数进行合理修正：乙醇浓度81%，液料比13 mL·g-1，提取时间30 min，重复提取3次进行验证，实验结果如表5所示，综合评分的平均值为2.20，与预测值2.14相差2.80%，说明该实验方法准确度高，稳定可靠，可用于当归中2种成分的含量测定。

3 讨论

本实验使用不同浓度的乙醇和甲醇分别对当归粉末进行提取，研究发现采用乙醇提取制备的浸膏中阿魏酸和藁本内酯含量均比甲醇高，且由于乙醇毒性较小，更加绿色环保，适应于工业化生产，所以选择乙醇作为提取溶剂。

氘代溶剂和内标物质的选择：合适的氘代溶剂对样品和内标均应具有良好的溶解性。内标应具有一个易于识别且不与待测峰重叠的谱峰。通过文献比较和筛选实验，选择廉价易得、性质稳定、不与待测物质发生反应、不与待测物的谱峰重叠的吡嗪作为内标物，其氢核磁峰在8.66 ppm;此外，DMSO-d6能够很好地溶解待测样品和内标物质，且不与其他峰重叠，因此选择DMSO-d6为溶剂。

本试验通过对乙醇浓度、液料比、提取时间三个因素进行考察，结果显示这三个单因素对当归药材中阿魏酸和藁本内酯两种成分同时提取有较大影响，并结合Box-Behnken中心组合设计试验进行提取工艺优化，优选出最佳提取工艺，为当归的有效开发利用提供参考。

目前当归中有效成分含量测定主要采用HPLC法，其具有流动相配备复杂、检测时间长、使用对照品等缺点。氢核磁共振定量法具有检测速度快，准确性高，重现性好，无需昂贵的对照品，仅用少量廉价的内标物质即可同步对多种成分进行含量测定等优点，已广泛应用于中药有效成分含量的测定（林珊等，2014;王志伟等，2016;Tanaka et al.，2017）。本研究采用氢核磁共振法同时测定当归中阿魏酸和藁本内酯含量，可以有效地降低成本，并且整个检测过程在3 min左右即可完成。

4 结论

本文以中药当归为研究对象，以氢核磁定量方法测定当归提取物中阿魏酸和藁本内酯含量，以阿魏酸和藁本内酯含量的综合评分为考察指标，采用单因素筛选结合Box-Behnken中心组合设计实验优化提取工艺参数，研究结果发现：

（1）当归中阿魏酸和藁本内酯的最佳提取工艺为乙醇浓度80.87%，液料比13.04 mL·g-1，提取时间30.14 min，在此条件下，2种成分提取综合评分为2.14。

（2）在最佳提取工艺条件下，测得当归中阿魏酸和藁本内酯含量分别为1.07 mg·g-1和6.98 mg·g-1，且该工艺条件操作简单，重复性好，对当归中有效成分提取有一定的参考价值。

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（责任编辑 李 莉）