任春芝 谢映红 王秋华 韦英益 胡庭俊

摘要：【目的】探讨猪伪狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）感染对小鼠单核巨噬细胞（RAW264.7）炎症反应的影响，确定PRV的最佳感染剂量和感染时间，为建立RAW264.7细胞体外病毒感染炎症反应模型打下基础。【方法】PRV按10倍递增稀释成10-5～10-1 PRV稀释液，感染RAW264.7细胞并孵育1.5 h，弃病毒液后加入含5%胎牛血清的DMEM维持培养液继续培养，分别于继续培养2、4、8、12、24和48 h时收集细胞上清液，采用ELISA测定IL-6、IL-10、IL-1β、TNF-α、MCP-1和IFN-γ分泌水平及环氧合酶（COX-1和COX-2）活性，并以CCK-8法测定细胞活性。【结果】以PRV感染RAW264.7细胞4～48 h后均能通过PCR扩增获得PRV核酸的特异性条带，故选择4～48 h作为后续研究的PRV感染时间范围;10-2 PRV～10-1 PRV感染可显著降低RAW264.7细胞活性（P<0.05，下同），10-3 PRV组仅在培养48 h时出现下降趋势，而10-5 PRV～10-4 PRV感染对RAW264.7细胞活性无显著影响。PRV感染RAW264.7细胞后，其胞内炎症因子IL-6、IFN-γ、TNF-α、IL-1β和MCP-1的分泌水平整体上呈升高趋势，其中10-3 PRV感染RAW264.7细胞12 h能显著或极显著（P<0.01）提高IL-6、IFN-γ、TNF-α、IL-1β和MCP-1的分泌水平;10-4 PRV～10-1 PRV感染组的IL-10分泌水平均呈升高趋势，而10-5 PRV感染组在感染8和24 h时IL-10分泌水平明显低于空白对照组，至感染48 h所有病毒感染组的IL-10分泌水平均降低;10-3 PRV～10-1 PRV感染8～24 h能有效提高RAW264.7细胞的COX-2活性，但对COX-1活性的影响不明显。【结论】PRV感染能诱导RAW264.7细胞发生炎症反应，其中10-3 PRV体外感染RAW264.7细胞8～12 h是建立RAW264.7细胞炎症反应模型的最佳條件。该模型可应用于PRV感染与RAW264.7细胞炎症反应相关干预药物的研究，为进一步揭示PRV感染机理及开发抗病毒感染药物提供理论依据。

关键词： 猪伪狂犬病毒（PRV）;RAW264.7细胞;体外诱导;炎症反应;炎症因子;环氧合酶

中图分类号： S852.659.1                                文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2021）05-1370-08

Abstract：【Objective】The effect of inflammatory reaction on RAW264.7 cells infected with pseudorabies virus（PRV）was investigated to establish the inflammatory response model in vitro by screening the best infective dose and infective time， and provide reference for establishing RAW264.7 in vitro virus infection inflammation model. 【Method】RAW264.7 cells were infected with five different concentrations of PRV which were diluted by serial 10 times to the concentration from 1×10-5 to 1×10-1 for 1.5 h. Then the virus liquids were discarded. Subsequently， the cells were plated in DMEM with 5% calf serum and then cell supernatants were collected after cultured for 2， 4， 8， 12， 24 and 48 h respectively. The le-vels of interleukin 6（IL-6）， interleukin 10（IL-10）， interleukin 1β（IL-1β）， tumor necrosis factor Alpha（TNF-α）， monocyte chemoattractant protein-1（MCP-1），interferon-γ（IFN-γ） and the activities of both cyclooxygenase 1（COX-1） and cyclooxygenase 2（COX-2） were determined by ELISA kits. The activities of cells were detected by CCK-8 method. 【Result】The specific bands of PRV nucleic acid were obtained by PCR amplification at 4-48 h post PRV infection in RAW264.7 cells， so 4-48 h was selected as the time range of PRV infection in the subsequent studies. The activities of RAW264.7 cells were significantly decreased in 10-2 PRV-10-1 PRV groups and only trended to decrease at 48 h in 10-3 PRV group（P<0.05， the same below）， however， there was no significant influence on the RAW264.7 cells activities in 10-5 -10-4 PRV groups. The secretion of inflammatory factors such as IL-6， IFN-γ， TNF-α， IL-1β and MCP-1 were increased in general after PRV infected RAW264.7 cells. 10-3 PRV infected RAW264.7 cells 12 h could significantly or extremely significantly（P<0.01） increase secretion levels of IL-6， IFN-γ， TNF-α， IL-1β and MCP-1. The secretion level of IL-10 was increased in 10-1 PRV-10-4 PRV groups， while notably lower than that in the blank control group at 8 and 24 h after infection in 10-5 PRV group， and the level was decreased at 48 h in all of the PRV infected groups. The secretion level of COX-2 was  increased for 8-24 h post infection in 10-3 PRV-10-1 PRV group， but there had no obvious effect on the secretion level of COX-1. 【Conclusion】PRV infection induces inflammatory reaction in RAW264.7 cells. 10-3 PRV infection in RAW264.7 cells in vitro for 8-12 h is considered as the optimal condition for the establishment of the inflammatory response model. This model can be applied to the study of PRV infection and inflammatory response in RAW264.7 cell which relates to the intervention action of drugs， and the results provide theoretical basis for reveal the mechanism of PRV infection and the development of anti-viral infection drugs.

Key words： pseudorabies virus （PRV）; RAW264.7 cell; in vitro induction; inflammatory response; inflammatory factor; cyclooxygenase

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（32072907，31560708）

0 引言

【研究意义】猪伪狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）可引起多种家畜和野生动物发病，猪是该病毒的唯一自然宿主，仔猪感染死亡率接近100%，给全球养猪业带来重大经济损失（Pontes et al.，2016;梁祺英等，2017）。PRV感染新生仔猪可导致其神经系统紊乱甚至死亡，感染怀孕母猪可造成流产，感染成年猪则引发呼吸系统疾病，且急性感染存活的猪群将终生带毒（Zhang et al.，2019）。感染PRV的猪群通过分泌物和排泄物传播病毒，主要通过直接接触传播，也可通过水和污染物传播。PRV疫苗免疫是预防猪伪狂犬病最有效的方法，Bartha-K61疫苗可有效控制PRV传播（华涛等，2019），但无法防治PRV变异毒株引起的感染。自2011年以来，我国部分接种Bartha-K61疫苗的养猪场仍然暴发猪伪狂犬病（An et al.，2013;Freuling et al.，2017），因此急需加强PRV感染致病機理研究，以寻找理想的抗病毒感染药物。【前人研究进展】PRV属于疱疹病毒科α-疱疹病毒亚科，为双链DNA病毒，可在幼仓鼠肾细胞（BHK-21）、胚胎成纤维细胞（CEF）、猪肾细胞（PK-15）及小鼠单核巨噬细胞（RAW264.7）等细胞中扩增，且研究发现扩增PRV最有效的细胞是PK-15细胞（彭丽英等，2011;李小静和唐满华，2015;程璇等，2020）。臧素芳等（2015）研究发现，PRV感染会减轻小鼠体重，并引起被毛凌乱及神经亢奋等症状，其脑组织有大量炎性细胞浸润。肖熹玉等（2016）发现PK-15细胞的增殖在PRV感染24 h后受到显著抑制，且与感染时间显著相关，与感染剂量不相关，同时观察到细胞凋亡现象。安娜等（2018）研究表明，人工感染PRV后猪体内免疫器官和下丘脑中的IL-1β表达水平显著升高，并对猪的免疫系统产生影响。病毒感染后通常引起明显的细胞病变，并刺激肿瘤坏死因子（TNF-α）、白细胞介素（IL）、干扰素（IFN）、趋化因子和集落刺激因子（CSF）等细胞因子过量分泌。李飞等（2016）研究发现，经猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）感染后，小鼠脾脏匀浆中的细胞因子分泌水平明显升高;谭红连等（2017）研究证实，以猪圆环病毒2型（PCV2）感染3D4/2细胞后，其TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10和MCP-1等炎症因子水平均明显升高。另有研究发现，乙型脑炎病毒感染小胶质细胞后可引起TNF-α、IL-6和MCP-1等促炎细胞因子过量释放，流感病毒感染宿主后则引起肺部发生急性炎症反应，炎症因子水平升高（庄忻雨等，2018;Dai et al.，2018）。【本研究切入点】可见，部分病毒感染可导致体内或体外的炎症反应发生，且目前已成功建立了多种病毒感染细胞炎症反应模型（张玲等，2016;谭红连等，2017;罗文涓等，2018），但有关PRV体外感染RAW264.7细胞引起炎症反应的研究尚无报道。【拟解决的关键问题】利用PRV体外感染RAW264.7细胞，测定IL-6、IL-10、IL-1β、TNF-α、MCP-1和IFN-γ分泌水平及COX-1和COX-2活性的变化，探讨PRV感染量和感染时间与RAW264.7细胞产生炎症因子水平的关联性，为建立RAW264.7细胞体外病毒感染炎症反应模型打下基础。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

PRV-GXLB-2013毒株由广西大学预防兽医学实验室提供，经PK-15细胞扩增，通过Reed-Muench法测定病毒滴度为107.2 TCID50/0.1 mL;PRV特异性扩增引物（上游引物5'-CGGCTTCCACTCGCAGCT CTTCTC-3'，下游引物5'-TGTGGGTCATCACGAG CACGTACAGC-3'）委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成;PK-15细胞和RAW264.7细胞由广西大学动物科学技术学院兽医药理与毒理学实验室保存提供。胎牛血清（FBS）和DMEM培养液购自美国Gibco公司;病毒基因组DNA提取试剂盒及PCR扩增试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司;IL-6、IL-10、IL-1β、TNF-α、MCP-1、IFN-γ、COX-1和COX-2等ELISA试剂盒均购自武汉云克隆科技股份有限公司。主要仪器设备有TS100-F倒置显微镜、Multimode Plate Reader多功能酶标仪、S1000梯度PCR仪和C150细胞培养箱等。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 筛选病毒感染时间 将8.0 mL含10%胎牛血清的DMEM完全培养液加入细胞瓶，在37 ℃、5% CO2恒温培养箱中扩增RAW264.7细胞。待细胞铺满瓶底70%～80%后用细胞刮刀刮下RAW264.7细胞，按1∶3的比例进行传代培养，待细胞达到一定数量后，取生长状态良好的细胞进行计数，并调节细胞浓度至1×105 Cells/mL，然后接种至24孔板（1 mL/孔），37 ℃、5% CO2恒温培养箱培养过夜，弃上清液，PBS洗3遍，分别加入PRV（200 μL/孔），继续孵育1.5 h，用PBS洗去残留病毒液，加入含5%胎牛血清的DMEM维持培养液继续培养。继续培养2、4、8、12、24和48 h后弃上清液，PBS洗2～3遍，分别收集细胞反复冻融，按照DNA抽提试剂盒说明提取DNA，并利用PRV特异性引物进行病毒核酸检测，以1.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。

1. 2. 2 试验分组及处理 试验设10-5～10-1 PRV稀释浓度感染组，设未感染细胞为阴性（空白）对照。用细胞刮刀刮下培养瓶中的RAW264.7细胞，1000 r/min离心5 min，弃上清液，加入DMEM完全培养液（含10%胎牛血清）轻轻吹打均匀，调整细胞终浓度为1×105 Cells/mL，接种至24孔板（1 mL/孔），37 ℃、5% CO2培养过夜后弃上清液，PBS洗3遍。空白对照组加入无血清的DMEM完全培养液（200 μL/孔），病毒组则分别加入不同浓度的病毒稀释液（200 μL/孔），继续孵育1.5 h，期间可晃动培养瓶使病毒液充分接触细胞。孵育结束后弃病毒液，PBS清洗残留病毒液，加入DMEM维持培养液（含5%胎牛血清）继续培养。分别于继续培养2、4、8、12、24和48 h时收集上清液用于测定细胞炎症反应指标，收集上清液后剩余的细胞则用于测定细胞活性。

1. 2. 3 CCK-8法测定细胞活性 新鲜配制含10% CCK-8试剂的无血清DMEM完全培养液，按100 μL/孔的剂量加入无上清液的24孔板中，继续孵育1.0 h，然后在酶标仪450 nm处测定OD值。

1. 2. 4 ELISA测定炎性反应指标 根据ELISA试剂盒说明分别检测细胞上清液中的IL-6、IL-1β、IL-10、MCP-1、IFN-γ和TNF-α含量及环氧合酶（COX-1和COX-2）活性。

1. 2. 5 统计分析 采用SPSS 23.0对试验数据进行单因素方差分析（One-way ANOVA），并以Excel 2010制图。

2 结果与分析

2. 1 PRV感染RAW264.7细胞时间的确定

RAW264.7细胞在PRV感染后继续培养4、8、12、24和48 h，抽提病毒DNA，经PCR扩增及1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，均获得大小约388 bp的特异性条带，而感染后继续培养2 h的细胞未扩增出对应的特异性条带（图1）。说明PRV能成功感染RAW264.7细胞，并选择感染4～48 h的细胞进行后续试验。

2. 2 PRV感染对RAW 264.7细胞活性的影响

如图2所示，PRV感染RAW264.7细胞后，10-3 PRV感染组的细胞活性在感染48 h时与空白对照组相比差异显著（P<0.05，下同）;10-2 PRV感染组的细胞活性在感染4、8和48 h时与空白对照组相比差异极显著（P<0.01，下同），在感染24 h时与空白对照组相比差异显著;10-1 PRV感染组的细胞活性除了在感染12 h时与空白对照组相比无显著差异（P>0.05，下同）外，其他时间点均极显著低于空白对照组。可见，10-2～10-1 PRV感染可显著降低RAW264.7细胞活性，10-3 PRV感染仅在培养48 h时出现下降趋势，而10-5～10-4 PRV感染对RAW264.7细胞活性无显著影响。

2. 3 PRV感染对RAW264.7细胞分泌IL-6的影响

如图3所示，PRV感染RAW264.7细胞后，仅10-1 PRV感染24 h、10-3 PRV感染8和12 h及10-4 PRV感染12 h的细胞内IL-6水平较空白对照组显著升高。说明10-3 PRV感染RAW264.7细胞8～12 h能显著提高其分泌IL-6的能力。

2. 4 PRV感染对RAW264.7细胞分泌IL-10的影响

如图4所示，与空白对照组相比，10-1 PRV感染RAW264.7细胞8 h其胞内IL-10水平极显著升高，但至感染48 h时IL-10水平极显著降低;10-2 PRV感染RAW264.7细胞8 h及10-3 PRV感染RAW264.7细胞8和24 h，其细胞内IL-10水平显著高于空白对照组;10-5 PRV感染RAW264.7细胞48 h后，细胞分泌IL-10的水平极显著低于空白对照组。可见，10-3 PRV感染RAW264.7细胞8～24 h能有效提高其分泌IL-10的能力。

2. 5 PRV感染对RAW264.7细胞分泌IFN-γ的影响

如图5所示，与空白对照组相比，10-1 PRV感染RAW264.7细胞8 h其胞内IFN-γ水平显著升高，感染24 h极显著升高;10-2 PRV感染4和12 h时RAW264.7细胞内的IFN-γ水平极显著升高，感染8 h时IFN-γ水平显著升高;10-3 PRV感染4 h时RAW264.7细胞内的IFN-γ水平呈下降趋势，但与空白对照组相比无显著差异，感染8和12 h时呈显著或极显著升高趋势;10-4 PRV感染RAW264.7细胞12 h其胞内IFN-γ水平显著升高。可见，10-2 PRV感染4～12 h及10-3 PRV感染8～12 h均能有效提高RAW264.7细胞分泌IFN-γ的能力。

2. 6 PRV感染对RAW264.7细胞分泌TNF-α的影响

如图6所示，PRV感染RAW264.7细胞后，在各时间点其胞内TNF-α水平均高于空白对照组。其中，10-1 PRV感染RAW264.7细胞8 h时其胞内TNF-α水平极显著高于空白对照组;10-2 PRV感染RAW264.7细胞12 h及10-3 PRV感染RAW264.7细胞8和12 h时其胞内TNF-α水平也极显著高于空白对照组;10-4 PRV感染RAW264.7细胞24 h时其胞内TNF-α水平显著高于空白对照组。即10-3 PRV感染8～12 h能有效提高RAW264.7细胞分泌TNF-α的能力。

2. 7 PRV感染对RAW264.7细胞分泌IL-1β的影响

如图7所示，以10-3 PRV～10-1 PRV感染RAW264.7细胞能有效提高其胞内IL-1β的分泌水平。与空白对照组相比，10-1 PRV感染RAW264.7细胞4和8 h时其胞内IL-1β水平极显著升高，感染24 h时显著升高;10-2 PRV感染RAW264.7细胞4和12 h时其胞内IL-1β水平显著升高;10-3 PRV感染RAW264.7细胞12 h时其胞内IL-1β水平极显著升高。以10-5 PRV和10-4 PRV感染RAW264.7細胞，其胞内IL-1β水平的变化趋势与空白对照组相比均无显著差异。

2. 8 PRV感染对RAW264.7细胞COX-1活性的影响

如图8所示，以PRV感染RAW264.7细胞，仅有10-1 PRV感染4 h及10-2 PRV感染24 h的胞内COX-1活性显著高于空白对照组外，其他PRV浓度感染组对RAW264.7细胞COX-1活性均无显著影响。

2. 9 PRV感染对RAW264.7细胞COX-2活性的影响

如图9所示，以不同浓度PRV感染RAW264.7细胞4 h，其胞内COX-2活性均无显著变化。10-1 PRV感染RAW264.7细胞8 h其胞内COX-2活性极显著高于空白对照组，10-2 PRV感染8和24 h其胞内COX-2活性显著或极显著高于空白对照组，10-3 PRV感染8和24 h其胞内COX-2活性显著高于空白对照组，而10-4 PRV感染12 h其胞内COX-2活性显著降低。可见，10-3 PRV和10-2 PRV感染8或24 h均能有效提高RAW264.7細胞COX-2的活性。

2. 10 PRV感染对RAW264.7细胞分泌MCP-1的影响

如图10所示，10-3 PRV～10-1 PRV感染RAW264.7细胞4、12和24 h其胞内MCP-1水平均极显著高于空白对照组;10-4 PRV感染RAW264.7细胞4和12 h其胞内MCP-1水平也极显著高于空白对照组。可见，10-3 PRV～10-1 PRV感染4、12或24 h均能有效提高RAW264.7细胞分泌MCP-1的能力。

3 讨论

炎症是机体对病毒或细菌感染及组织损伤等刺激的一种防御反应，但过度的炎症反应会损伤机体，引起实质器官变性、坏死及功能衰竭。RAW264.7细胞是建立体外炎症反应模型的常用细胞，细菌和病毒等致病因素均可诱导RAW264.7细胞产生多种细胞因子、炎性介质及趋化因子等（Lin et al.，2012;Liao et al.，2018;Tebakari et al.，2018）。本研究以RAW264.7细胞为体外炎症反应模型细胞，通过探究病毒感染RAW264.7细胞后炎性因子的分泌水平及环氧合酶活性的变化，建立PRV感染RAW264.7细胞体外炎症反应模型，为进一步揭示PRV感染机理及研发抗病毒感染药物提供理论依据。

炎症前期细胞因子如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8和MCP-1等具有免疫作用，可导致机体产生炎症反应，在细胞免疫及其介导的炎症反应中发挥重要作用（Lin et al.，2017;首姣琴等，2019）。TNF-α是重要的早期炎症因子，调节细胞的增殖、分化及凋亡等过程，在造血和抗病毒方面具有重要意义，同时可刺激活化IL-6和IL-1β。IL-6具有抗炎和促炎的双向功能，参与机体的免疫应答和免疫调节，IL-6在正常水平下有利于机体的防御作用，但产生过多会引起炎性损伤，在多种炎症相关疾病中均伴有IL-6水平的升高，且对单核巨噬细胞具有趋化作用（张海等，2014;Saiki et al.，2018）。IL-1β是内皮细胞活化因子，在病毒感染机体后调节炎症反应，常与TNF-α产生协同作用。MCP-1是由单核细胞、成纤维细胞、巨噬细胞及B细胞等分泌的小分子蛋白，是重要的促炎因子，通过吸引炎性细胞迁移至损伤部位而特异性激活单核/巨噬细胞系统（邹莉等，2018）。张玲等（2016）研究发现，以PRRSV体外感染RAW264.7细胞，其细胞存活率明显降低，而胞内TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1和IFN-γ等炎症因子的分泌水平极显著升高。张晓音等（2017）采用ELISA和实时荧光定量PCR检测脂多糖（LPS）刺激后的巨噬细胞，结果表明其胞内IL-1β、IL-6和TNF-α等炎症因子的分泌水平显著升高，即巨噬细胞发生了炎症反应。本研究结果表明，以PRV感染RAW264.7细胞4～48 h后均能通过PCR扩增获得PRV的特异性条带，故选择4～48 h作为后续研究的PRV感染时间范围;10-5 PRV～10-3 PRV稀释浓度对RAW264.7细胞无明显毒性影响，可作为试验用的安全浓度范围。此外，PRV感染RAW264.7细胞后，其胞内炎症因子IL-6、IFN-γ、TNF-α、IL-1β和MCP-1的分泌水平整体上呈升高趋势，即这些炎症介质已参与病毒感染所致的炎症反应过程，与张玲等（2016）的研究结果一致。

IL-10作为一种抗炎因子，能抑制单核巨噬细胞释放IL-6、IL-1β、TNF-α和IFN-γ等多种炎症因子，并降低细菌或病毒诱导所造成的损害（Villela-Castrejón et al.，2017）。有研究表明，IL-10能降低LPS诱导内毒素血症小鼠血清TNF水平，并减轻实验动物模型关节肿胀、细胞浸润及细胞因子合成（濮海平，2004）。机体发生炎症损害时，巨噬细胞在释放促炎因子的同时释放抗炎因子，使机体免疫应答趋于平衡，当这种平衡失调就会导致炎症反应加重，器官功能障碍甚至衰竭。因此，一定范围内促进细胞产生IL-10有利于治疗炎症疾病（郭伟强等，2008;张丽娜，2012）。本研究发现，PRV感染RAW264.7细胞24 h内，10-4 PRV～10-1 PRV感染组的IL-10分泌水平均呈升高趋势，而10-5 PRV感染组在感染8和24 h时IL-10分泌水平明显低于空白对照组，至感染48 h所有病毒感染组的IL-10分泌水平均降低。该结论揭示了炎症反应的复杂性及IL-10的多重调节功能。环氧合酶分为COX-1和COX-2，能将花生四烯酸催化为具有活性的前列腺素，促进炎症反应的发生，在病毒感染及LPS等刺激因子的作用下高表达，其中COX-2与炎症发生密切相关（吴磊等，2012）。本研究中，10-3 PRV～10-1 PRV感染8～24 h能有效提高RAW264.7细胞COX-2活性，但对COX-1活性的影响不明显。

4 结论

PRV感染能诱导RAW264.7细胞发生炎症反应，其中10-3 PRV稀释浓度体外感染RAW264.7细胞8～12 h是建立RAW264.7细胞炎症反应模型的最佳条件。该模型可应用于PRV感染与RAW264.7细胞炎症反应相关干预药物的研究，为进一步揭示PRV感染机理及开发抗病毒感染药物提供理论依据。

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（責任编辑 兰宗宝）