佟莉蓉， 倪顺刚， 任星远， 刘嘉欣， 闻 静， 王 娟， 宋 雨

(山西农业大学草业学院， 山西 太谷 030801)

达乌里胡枝子(Lespedezadavurica)作为黄土高原优质的乡土牧草，具有耐寒、耐旱和耐贫瘠等优良特性，在恢复黄土高原天然草地植被、控制水土流失、促进生态系统良性循环等方面具有重要作用，也可作为饲用、药用和食用植物，具有较高的开发和利用价值[1-2]。干旱是影响植物生长发育的主要非生物因素之一，不仅影响植物生长发育，也降低了植物的生产力，而达乌里胡枝子主要产地在干旱半干旱地区，极易受到干旱胁迫的影响，尤其是在对土壤水分利用能力较弱的幼苗阶段[3]。因此，在苗期保障达乌里胡枝子幼苗免受干旱胁迫伤害显得极为重要。

褪黑素(Melatonin，MT)又称松果体素，广泛分布于动植物中，可通过影响多种代谢途径来调节或增强植物抗逆性，可以缓解重金属胁迫、干旱胁迫、低温或高温逆境对高等植物的损害[4]。已有的研究发现，褪黑素可以缓解逆境对黄瓜(Cucumissativus)[5]、番茄(Solanumlycopersicum)[6]、玉米(Zeamays)[7]和小麦(Triticumaestivum)[8]等植物幼苗带来的伤害，促进其生长。大量研究表明，施用褪黑素不仅可以促进种子萌发，促进植物根系发育，还可保护叶绿素，延缓叶片衰老，增强植物抵御逆境胁迫[9-13]。但目前而言，褪黑素在牧草资源上的应用研究较少。因此，本研究以乡土牧草达乌里胡枝子幼苗为材料，通过分析幼苗阶段的生长状况、水分特性以及渗透调节物质等方面，研究在干旱胁迫下不同浓度外源褪黑素对达乌里胡枝子幼苗生长及叶片水分生理的影响，筛选最佳的施用浓度，以期为达乌里胡枝子的抗旱栽培提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试品种‘晋农 1号’达乌里胡枝子为山西农业大学草业学院自主选育通过国审的新品种，生产年份为2017年，裸种千粒重约为2.215 g，种子含水量约11.26%。褪黑素(分析纯)购于南京都莱生物技术有限公司。

1.2 试验方法

共设置7个处理，即WMT0(正常供水+0 μmol·L-1MT)，DMT0(干旱胁迫+0 μmol·L-1MT)，DMT1(干旱胁迫+25 μmol·L-1MT)，DMT2(干旱胁迫+50 μmol·L-1MT)，DMT3(干旱胁迫+100 μmol·L-1MT)，DMT4(干旱胁迫+ 200 μmol·L-1MT)和DMT5(干旱胁迫+400 μmol·L-1MT)，每个处理4次重复。

供试种子于6月24号播种于规格为15 cm×10 cm×15 cm(上径×下径×高)白色塑料花盆中，每盆装基质3.0 kg (培养基质为沙土体积比1∶2的混合物，土壤pH值约为7.5，最大田间持水量为30.85%)。播种量为每盆30颗。为保障营养供给，在生长至第15 d后每盆间苗到15株，并浇灌一次200 mL 1/2霍格兰氏营养液。在培养到第5周后开始进行褪黑素喷施，连续3 d在傍晚喷施各处理相对应的褪黑素(含适量吐温-20作为叶片表面活化剂，增强叶片吸收褪黑素的能力)，叶片正面和反面均进行喷施，喷施量以水滴刚好不下落为宜，WMT0和DMT0分别喷施等量蒸馏水。3 d的喷施处理完成后，每盆均浇水至最大田间持水量。浇足水后WMT0处理保持田间持水量的80%，其他组通过自然干旱法进行15 d干旱处理，盆栽放置位置采用随机区组设计，每隔5 d调换盆方向，确保各盆各面受光条件相同。

1.3 测定指标

1.3.1鲜重 干旱胁迫处理完成后，每个处理随机取5株植株用纯水清洗并拭干，从根茎结合部将地上部和地下部分开，分别测定鲜重。

1.3.2水分指标 分别在0，5，10 d和15 d取达乌里胡枝子叶片约0.2 g，清洗表面杂物，称出鲜重，将叶片放入105℃烘箱中杀青15 min，之后放入80℃烘箱烘干至恒重，称出干重，叶片鲜干比=鲜重/干重。另取5片达乌里胡枝子成熟叶片，称出鲜重，浸入超纯水中12 h后称出饱和重，之后放入将叶片放入105℃烘箱中杀青15 min，之后放入80℃烘箱烘干至恒重，称出干重。公式计算方法如下[14]：

叶片含水率(Leaf moisture content)=(鲜重—干重)/鲜重

叶片相对含水量(Leaf relative water content)=(鲜重—干重)/(饱和重—干重)

叶片水分饱和亏(Leaf water saturation deficit)=(饱和重—鲜重)/(饱和重—干重)

1.3.3渗透调节物质 可溶性糖含量采用硫酸-蒽酮比色法测定；可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝G-250 比色法测定；游离脯氨酸含量采用酸性茚三酮比色法测定[15]。

1.4 数据处理

通过Microsoft Office Excel 2007进行数据整理，利用SPSS 25.0进行单因素方差分析，并用最小差异显著法(Least significant difference，LSD)进行多重比较，运用Origin Version 2018进行绘图，所有数据采用平均值±标准误的形式表示。

2 结果与分析

2.1 外源MT对干旱胁迫下达乌里胡枝子幼苗鲜重的影响

与WMT0处理相比，DMT0处理的地上部分、地下部分以及整体鲜重分别降低了41.27%，61.91%和55.72%(P<0.05)(图1)，说明干旱胁迫限制了达乌里胡枝子幼苗的生长；添加适宜浓度的外源MT对干旱胁迫下达乌里胡枝子幼苗生长有明显的改善，其中DMT3处理效果最为显著。与DMT0处理相比，DMT3处理下达乌里胡枝子地下部分、地上部分以及整体鲜重分别增加了44.62%，87.96%和70.70%，其中地上部分以及整体鲜重差异显著(P<0.05)。结果显示，叶面喷施一定浓度外源MT能有效缓解干旱胁迫对达乌里胡枝子幼苗地上部分的抑制现象，其中100 μmol·L-1MT对干旱胁迫下达乌里胡枝子幼苗的生长促进效果最好。

图1 外源MT对干旱胁迫下达乌里胡枝子幼苗不同部位鲜重的影响Fig.1 Effects of exogenous melatonin on fresh weight of L. davurica seedlings in different part under drought stress注：图中不同小写字母代表不同处理同一指标间差异显著(P<0.05)。图中WMT0代表正常水分处理，不进行叶面喷施MT处理；DMT0代表干旱胁迫处理，不进行叶面喷施MT处理；DMT1代表干旱胁迫处理并喷施25 μmol·L-1 MT；DMT2代表干旱胁迫处理并喷施50 μmol·L-1 MT；DMT3代表干旱胁迫处理并喷施100 μmol·L-1 MT；DMT4代表干旱胁迫处理并喷施200 μmol·L-1MT；DMT5代表干旱胁迫处理并喷施400 μmol·L-1 MT。下同Note:Different lowercase letters in the figure represent significant differences between different treatments at the 0.05 level. WMT0 represent non-drought treatment without MT;DMT0 represent drought treatment without MT;DMT1 represent drought treatment with 25 μmol·L-1 MT;DMT1represent drought treatment with 25 μmol·L-1 MT;DMT2 represent drought treatment with 50 μmol·L-1 MT;DMT3 represent drought treatment with 100 μmol·L-1 MT;DMT4 represent drought treatment with 200 μmol·L-1MT;DMT5represent drought treatment with 400 μmol·L-1 MT. The same as below

2.2 外源MT对干旱胁迫下达乌里胡枝子幼苗水分特性的影响

在持续的干旱胁迫下，达乌里胡枝子的叶片鲜干比、叶片相对含水量、叶片含水率呈持续降低趋势，而叶片水分饱和亏缺呈持续升高趋势(表1)。在干旱胁迫的前5 d，不同浓度外源MT处理下的叶片鲜干比、叶片相对含水量、叶片含水率和水分饱和亏缺与DMT0处理相比差异均不显著。在干旱胁迫第15 d时，DMT2和DMT3的处理比DMT0处理的叶片鲜干比分别提升了15.81%和16.11%(P<0.05)；与DMT0处理比较，不同浓度外源MT处理下叶片相对含水量分别提升了3.87%，11.75%，16.30%，10.84%和0.99%，其中DMT3处理与DMT0处理存在显著差异(P<0.05)；不同浓度外源MT处理下叶片水分饱和亏缺与DMT0处理比较，分别降低了8.10%，24.54%，34.10%，22.06%和2.07%，DMT3处理与DMT0处理差异显著(P<0.05)。总体而言，MT处理虽然能提高干旱胁迫下达乌里胡枝子叶片鲜干比、叶片相对含水量和叶片含水率，但影响较小，其中100 μmol·L-1MT效果最明显。

表1 外源MT对干旱胁迫下达乌里胡枝子幼苗叶片水分特性的影响Table 1 Effects of exogenous melatonin on leaf water characteristics of L. davurica seedlings under drought stress

2.3 外源MT对干旱胁迫下达乌里胡枝子幼苗渗透调节物质的影响

在持续的干旱胁迫下，达乌里胡枝子叶片的可溶性糖、可溶性蛋白含量呈先升高后降低趋势，游离脯氨酸含量则呈持续上升趋势(图3)。在干旱胁迫第5 d时，DMT2，DMT3和DMT4处理的可溶性糖含量与DMT0处理比较，增加了14.36%，25.27%和28.21%(P<0.05)；DMT3处理的可溶性蛋白含量与DMT0处理差异显著(P<0.05)；DMT4和DMT5处理的游离脯氨酸含量与DMT0处理差异显著(P<0.05)。在干旱胁迫第10 d时，DMT1和DMT3处理的可溶性糖含量与DMT0处理差异显著(P<0.05)；DMT3，DMT4和DMT5处理的可溶性蛋白显著高于DMT0处理(P<0.05)。在胁迫第15 d时，DMT2，DMT3和DMT4处理的可溶性糖含量较DMT0处理分别提高了53.82%，43.83%和29.10%(P<0.05)；不同浓度外源MT处理下的可溶性蛋白含量均显著高于DMT0处理(P<0.05)；DMT2，DMT3和DMT5处理的游离脯氨酸含量与DMT0处理比较，分别提高了17.00%，28.68%和30.21%(P<0.05)。

图2 外源MT对干旱胁迫下达乌里胡枝子幼苗叶片渗透调节物质的影响Fig.2 Effects of exogenous melatonin on osmotic adjustment substances in leaves of L. davurica seedlings under drought stress

2.4 综合评价

采用模糊数学隶属函数法[16]对干旱胁迫末期(15 d)下不同浓度MT处理(DMT0，DMT1，DMT2，DMT3，DMT4和DMT5)对达乌里胡枝子的几个关键指标进行综合评价，结果表明(表2)，干旱胁迫下，外源MT处理的隶属值均比未喷施MT效果要好，其中100 μmol·L-1MT喷施效果最佳。喷施效果顺序依次为100 μmol·L-1>50 μmol·L-1>200 μmol·L-1>25 μmol·L-1>400 μmol·L-1>0 μmol·L-1MT。

表2 MT浓度对缓解达乌里胡枝子干旱胁迫效应的综合评价分析Table 2 Comprehensive evaluation of melatonin concentration on alleviating drought stress of L. davurica

3 讨论

在自然环境条件下，干旱胁迫是重要的非生物逆境，它会导致植物细胞膜透性增大，膜脂过氧化作用加剧，进而影响植物的生长发育，导致其代谢紊乱，加速其衰老和死亡[17]。而外源植物生长调节剂是缓解生物、非生物胁迫的一种方法，通过调控植物体内多个生理生化进程来直接或间接地提高植物的抗性。本研究发现干旱胁迫下达乌里胡枝子幼苗的地下部分、地上部分以及整体鲜重均受到显著抑制，其中干旱胁迫对地上部分的抑制效果大于地下部分，该结论与Lemoine等[18]结论一致，其研究发现干旱胁迫对植物地上部分的伤害要显著高于地下部分。前人研究认为，施加一定浓度的MT均可对植物地上部和地下部的鲜重产生影响。邹京南等[19]在对大豆的研究中也发现，在干旱胁迫下叶面喷施褪黑素能明显促进地上部分鲜重的增加，而对地下部分鲜重影响较小，研究中认为在大豆叶面喷施的褪黑素主要通过气孔吸收，使其主要存在于叶片细胞中，通过维管束及筛管等运输途径到地下部则较少。尉欣荣等[20]研究表明，在干旱与低温胁迫下施加100 μmol·L-1浓度MT可以显著提高多年生黑麦草幼苗鲜重并降低了相对电导率，进一步的研究发现，MT能够诱导植物体内抗氧化酶活性增强和脯氨酸积累，有效地清除活性氧，从而缓解了多年生黑麦草的生长抑制，增强了其抗寒和抗旱性。杨新元[21]研究也发现施加不同浓度MT可对干旱胁迫下向日葵幼苗的生长产生影响，以浓度100 μmol·L-1促进效果最佳。以上结论与本研究相似，本研究发现100 mol·L-1的MT对干旱胁迫下达乌里胡枝子幼苗生长的促进效果最好，其中对地上部分促进作用较为明显，原因可能是叶面喷施时，褪黑素主要通过气孔吸收的方式存在于地上茎叶中，导致植物地上部细胞MT浓度增加，从而促进了干旱胁迫下达乌里胡枝子幼苗的成长。

植物叶片保水能力的强弱代表植物体内耗散水分的高低，保水能力越强，植物耗散水分量也越少，这是植物自身对干旱的适应选择[22]。本研究发现，达乌里胡枝子叶片在干旱程度持续增加时，其叶片鲜干比、叶片含水率、叶片相对含水量均呈现降低趋势，相反，叶片水分饱和亏呈上升趋势，在胁迫至第10 d和15 d时均与正常供水组差异显著，说明干旱胁迫使达乌里胡枝子体内水分含量减少，抑制了达乌里胡枝子幼苗的正常生长。在杨树[23]上的研究也发现，随着干旱胁迫强度的增加，杨树苗叶片的相对含水量呈下降的趋势，且胁迫越严重下降的幅度越大。MT可以调节干旱胁迫下植物对水分的利用能力，减缓干旱胁迫的伤害。在本研究中，外源MT处理对达乌里胡枝子的干旱效应有一定的缓解作用，经过MT处理后，达乌里胡枝子的叶片鲜干比、叶片含水率、叶片相对含水量均有不同程度的提升，叶片水分饱和亏呈下降趋势。说明适宜浓度的MT可以提高干旱胁迫下植物水分的吸收、转运和保存能力，使植物有较强的抗旱性，其中以100 μmol·L-1MT浓度处理效果最好。邹京南等[19]研究发现，MT能提高干旱胁迫下大豆叶片相对含水量。马乐元[15]则认为一定浓度的生长调节物质也可在干旱胁迫下促进小冠花的水分调节能力，提高叶片鲜干比、叶片含水率、叶片相对含水量。罗兴雨[24]也认为施加100 μmol·L-1褪黑素能使燕麦叶片在干旱胁迫下维持较高的相对含水量，提高植物鲜重，减轻干旱对植物生长的抑制现象。因此，施加适宜浓度的外源MT可以提高达乌里胡枝子在干旱胁迫下植物保水能力，能使植物叶片有较高的水分，使植株有较高的抗旱性。

干旱胁迫下，细胞缺少水分，蛋白质的多肽链逐渐分解，使蛋白的结构发生极大的形变，蛋白质降解为各类可溶性蛋白和游离态的氨基酸[25-26]。游离态脯氨酸和可溶性蛋白是生物体内重要的渗透调节物质，植物通过在细胞内累积大量的游离态脯氨酸和可溶蛋白，提高束缚水的含量，保持原生质体的稳定，缓解干旱效应[27]。可溶性糖主要包括葡萄糖、果糖等单糖类物质，是呼吸作用的最主要的底物之一，是重要的碳源，与碳代谢紧密联系在一起[28]。本试验研究发现，干旱胁迫下脯氨酸含量持续升高，而可溶性糖和可溶性蛋白含量呈先升高后降低趋势，说明在干旱后期达乌里胡枝子遭受到干旱胁迫的伤害，渗透调节能力减弱，该研究结论同Niknam等[29]在烟草(Nicotianatabacum)上的研究结果一致。同时本研究还发现外源施加一定浓度MT可以有效提高达乌里胡枝子在干旱胁迫下游离脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白的含量，这与刘月等[30]在大豆的结果和王芳等[31]在玉米上的结果相一致。原因可能是外源MT减缓了膜脂过氧化，维持了细胞膜蛋白和原生质体的稳定，在干旱后期使植物体内还有较高的游离脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白含量，而高含量的渗透调节物质又能提高植物的保水能力，防止细胞脱水，减缓了干旱胁迫带来的伤害。

本研究通过叶面喷施的方式来探究干旱胁迫下达乌里胡枝子的生长状况，发现MT可以显著促进地上部的生长，但通过地下部灌根的方式进行处理是否会影响到地下部的生长还需进一步的验证。此外，MT作为一个内源植物激素，不仅调控植物逆境下的生理生化活动，也可以影响到多种激素代谢过程，本研究虽通过施加外源施加MT对干旱胁迫下达乌里胡枝子的水分生理及渗透调节物质进行研究，发现MT可以改善逆境下达乌里胡枝子的水分状况，但就褪黑素是否还可以调控植物的光合作用或是活性氧代谢等生理活动，或是调控抗逆基因的表达，从而进一步影响到达乌里胡枝子体内其他内源激素含量还需进一步研究。

4 结论

与干旱对照相比，施加适宜浓度的外源MT可显著提高达乌里胡枝子的鲜重、叶片鲜干比、叶片相对含水量、可溶性糖、可溶性蛋白和游离脯氨酸含量，并降低水分饱和亏缺，表明外源褪黑素可促进苗期植物的抗旱性。通过模糊隶属函数分析进一步发现，提高达乌里胡枝子幼苗抗旱性的外源MT最佳浓度为100 μmol·L-1。