陈荣珠 赖钟雄

(1漳州卫生职业学院药学系福建漳州 363000;2福建农林大学园艺植物生物工程研究所福建福州 350002)

DNA甲基化在真核基因组中作为一种常见的表观遗传修饰，具有调控特定基因表达的功能，其过程以S-腺苷蛋氨酸（SAM）作为甲基的供体，在DNA甲基转移酶的作用下，将甲基转移到胞嘧啶第5位碳原子上，使之变为5-甲基胞嘧啶（5-mC）［1］。在植物中，DNA甲基化被分为三种序列，分别是CG、CHG和CHH（H代表A、T或C），它们通过不同的酶来维持［2-3］。在拟南芥的研究中发现，CG、CHG和CHH分别需要甲基转移酶1（METHYLTRANS‐FERASE1，MET1）、CHROMOMETHYLASE3（CMT3）和CMT2来维 持［4-6］。RNA介导 的DNA甲 基化（RdDM）途径能使以上3种序列的DNA甲基化，其活性与转座子、重复序列以及某些基因被抑制有关［7］。经典的RdDM途径始于植物特异性RNA聚合酶Pol IV产生的转录本［8］，这些转录本由RNA依赖的RNA聚合酶2（RDR2）被转化为双链RNA［9］，然后在DIC‐ER-LIKE3（DCL3）酶的作用下被切割成24 nt的干扰小RNA（siRNA）［10］。最后，这些24 nt的siRNAs被装载到ARGONAUTE4（AGO4）中［11］，并招募从头甲基转移酶（DOMAINS REARRANGED METHYLTRANS‐FERASE2，DRM2），从而使靶向区域甲基化［12-13］。5-氮胞苷（5-azacytidine，5-azac）是DNA甲基化抑制剂，为核苷类似物，能够选择性地使某些基因被激活，从而使一些真核细胞的分化状态得到改变。DNA甲基化可以影响植株的生长发育，用5-azac处理甘蓝幼苗、水稻种子和麻风树，其DNA甲基化水平降低，叶片显著变小、植株出现矮化［14-16］。5-azac处理对植物的开花也具有一定的影响，一定浓度的5-azac处理亚麻种子［17］、拟南芥［18］、菊花［19］、杜鹃［20］和花椰菜［21］等均能降低DNA甲基化水平，促使它们提前开花，推测DNA甲基化水平的改变，能使开花相关基因的启动子DNA去甲基化，活化基因表达，从而使植物开花的时间提前。DNA甲基化水平也能影响果实的成熟时间和果皮的颜色，用不同浓度的5-azac喷施巨峰葡萄［22］、番茄果实［23］和草莓［24］等均能促进果实提前成熟。同样，在植物体胚发生过程中，伴随着DNA甲基化/去甲基化的动态平衡，一定程度的DNA甲基化水平对植物体胚的正常发育具有非常重要的作用。von Aderkas等［25］认为，植物体胚发生受到DNA甲基化调控，球形胚阶段DNA甲基化水平降低，但在鱼雷形胚阶段急剧上升，说明体胚发生过程伴随着DNA甲基化水平的变化。郝玉金等［26］研究发现，柑橘具有体胚发生能力的愈伤组织比非体胚发生能力的愈伤组织的DNA甲基化水平更低，说明胚性愈伤组织通过DNA去甲基化致使部分基因选择性表达。Chakrabarty等［27］发现，刺五加种胚性愈伤组织与非胚性愈伤组织相比，具有较低的甲基化水平，胚性愈伤组织具有发育成再生苗的能力，而非胚性愈伤组织却没有，说明较低水平的甲基化的愈伤组织有利于胚胎的发生。巴西橡胶树体细胞胚发生过程中不同体胚阶段，其DNA甲基化程度不同［28］。SANTOS等［29］分析了DNA甲基化对拟南芥体胚发生（SE）的影响，SE过程中整体DNA甲基化水平降低，用5-azac处理后SE反应能力降低。

龙眼（Dimocarpus longanLour.）属于无患子科龙眼属热带或亚热带的常绿木本果树，其果肉富含丰富的营养物质，是我国南方名贵的珍品，历来就有“南桂圆北人参”的说法。本课题组研究发现，龙眼体胚发生伴随着DNA甲基化水平的变化，参与RNA介导的DNA甲基化途径中的DlAGO4、DlDCL4和甲基转移酶DlDRM1均影响龙眼早期体胚的发生［30-32］。但是，5-azac与2，4-D处理对植物体胚发生的影响目前报道还比较少。因此，本研究以龙眼胚性愈伤组织为材料，用不同浓度的5-azac和2，4-D进行处理，观察其对龙眼早期体胚发生的影响，并利用RT-qPCR检测DlAGOs的表达水平，为揭示龙眼体胚发生过程的DNA甲基化作用机制提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

福建农林大学园艺植物生物工程研究所长期继代培养的龙眼松散型胚性愈伤组织（红核子品种LC2细胞系），试验仪器为LightCycler480 Re‐al-time PCR仪。

1.2 方法

1.2.1 不同浓度5-氮胞苷配置

5-azac购自sigma公司，称取0.1 g的5-azac用无菌水进行溶解，定容至终浓度为100 mmol/L，在无菌操净工作台中对其进行抽滤灭菌，并分别稀释成5、25、50µmol/L，最后加入到已高压灭菌的MS＋2，4-D（0.1、0.5 mg/L）固体培养基中置于无菌培养室中备用。

1.2.2 材料处理

称取约0.15 g生长状态良好的龙眼胚性愈伤组织置于不同浓度5-azac（0、5、25、50µmol/L）的MS＋2，4-D（0.1、0.5 mg/L）的培养皿中，暗培养18 d。以上每种处理3次重复。

1.2.3 龙眼早期体胚形态观察

用OLYMPUS倒置荧光显微镜观察不同处理龙眼早期体胚的形态。

1.2.4 总RNA的提取和cDNA逆转录

总RNA的提取及实时荧光定量PCR（RT-qPCR）所用cDNA的逆转录分别用Tripue（Transgen，China）和PrimerScript RT Reagent Kit（Takara）试剂盒进行。

1.2.5DlAGOs实时荧光定量PCR

以龙眼DlFeSOD作为内参基因，依据RT-qPCR引物设计的原则，用DNAMAN 6.0软件进行DlAGOs家族引物的设计（表1）。RT-qPCR反应体系参照SYBR Premix Ex Taq II（TAKARA）试剂盒使用说明书，SYBR Premix Ex Taq II 10µL，上下游引物（10µmol/L）各0.8µL，cDNA 1.0µL，用ddH2O补足20.0µL。

RT-qPCR反应程序：95℃预变性30 s，95℃变性5 s，58～61℃退火30 s，72℃延伸10 s，共进行40个循环，通过分析溶解曲线来确定扩增反应的特异性。为了减少误差，所有样品均做3次重复，将Ct值用内参基因校正后，用2-ΔΔCt法计算，获得每个基因的相对表达量。

1.2.6 数据处理

数据分析用Excel和SPSS，绘图用GraphPad Prism进行。

2 结果与分析

2.1 5-azac与2，4-D处理对龙眼早期体胚发生的影响

利用显微镜观察不同浓度5-azac与0.1 mg/L 2，4-D处理对龙眼早期体胚发生的影响，结果如图1所示，对照组（图1-a）、5-azac浓度为5µmol/L（图1-b）和25µmol/L（图1-c）处理组均出现了球形胚。进一步观察发现，当培养基中5-azac浓度为25µmol/L比添加5µmol/L和对照组中球形胚更典型、数量更多，而5-azac浓度为50µmol/L的处理组中未形成球形胚（图1-d）。

图1 不同浓度5-azac和2，4-D 0.1 mg/L处理对龙眼早期体胚发生的影响

显微镜观察发现，不同浓度5-azac与0.5 mg/L 2，4-D配合使用影响了龙眼早期体胚的发生（图2），只有5-azac浓度为5µmol/L的处理组可以观察到球形胚的产生（图2-b），而对照组（图2-a）和其它处理组均没有球形胚产生。而5-azac浓度为25和50µmol/L的处理组中龙眼胚性愈伤组织（图2-c、2-d）与对照组相比显得更松散。

2.2 5-azac和2，4-D处理对DlAGOs表达的影响

为了进一步分析不同浓度5-azac和2，4-D处理对DlAGOs相对表达量的影响，利用RT-qPCR技术进行检测。不同浓度5-azac与0.1 mg/L 2，4-D配合使用对DlAGOs表达的影响，如图3所示。不同浓度5-azac与0.1 mg/L 2，4-D配合使用与对照组相比，能降低DlAGO1、DlAGO2、DlAGO7和DlAGOMEL1的表达水平。DlAGO5、DlAGO6和DlAGO10的相对表达量先下降后上升，当5-azac浓度为50µmol/L时有最高的相对表达量，高于对照组。DlAGO4基因的相对表达量呈先上升后下降趋势，且在5-azac浓度为25µmol/L时有最高的表达量。

DlAGOs在不同浓度5-azac与2，4-D 0.5 mg/L处理下的表达模式如图4所示。5µmol/L 5-azac与0.5 mg/L 2，4-D配合使用能显著降低DlAGO1、DlAGO5、DlAGO6和DlAGOMEL1基因的相对表达量，当5-azac浓度提高到25和50µmol/L时，这些基因的相对表达量显著升高。不同浓度5-azac与0.5 mg/L 2，4-D配合使用能显著提高DlAGO2和DlAGO4的相对表达量，当5-azac浓度为5时，DlAGO4有最高的相对表达量，结合显微观察到的球形胚结构，推测该基因在龙眼球形胚的形成中发挥着重要的作用；5µmol/L 5-azac与0.5 mg/L 2，4-D配合使用能显著提高DlAGO7的相对表达量，增加5-azac的浓度反而显著降低该基因的相对表达量。

图2 不同浓度5-azac和2，4-D 0.5 mg/L处理对龙眼早期体胚发生的影响

图3 不同浓度5-azac和2，4-D 0.1 mg/L处理下DlAGOs的表达模式分析

综上所述，本研究推测DlAGOs基因家族成员能够响应5-azac与2，4-D的处理，但是不同的成员有不同响应模式，5-azac能降低龙眼胚性愈伤组织的DNA甲基化水平，2，4-D能增加其DNA甲基化水平，当2，4-D浓度较低时，一定浓度的5-azac能促进龙眼球形胚的产生，结合显微观察及相对表达量的结果可知，DlAGO4在龙眼球形胚的形成中发挥着重要的作用。

3 讨论与结论

3.1 5-azac通过降低龙眼胚性愈伤组织的甲基化水平而促进龙眼早期体胚的形成

图4 不同浓度5-azac和2，4-D 0.5 mg/L处理下DlAGOs的表达模式分析

DNA甲基化是迄今为止研究最广泛的表观遗传学内容之一，在所有植物中都发现有DNA甲基化现象存在。DNA甲基化水平对于维持正常的细胞功能和胚胎发育具有重要的作用。5-azac是常用的甲基化抑制剂，一定浓度可以促进细胞的生长，但是高浓度却会对细胞造成毒害作用。李顺福［33］在研究山核桃幼胚不同发育时期的DNA甲基化水平和模式时发现，不同发育时期DNA甲基化水平不一样、DNA甲基化类型也有所不同；对南瓜体细胞胚胎发生过程中DNA甲基化的变化进行研究发现，在体胚成熟阶段DNA甲基化水平是下降［34］。

5-azac已经在一些植物体胚形成过程中被使用，能够降低植物的DNA甲基化水平，从而促进植物体胚的形成。在海岸松（Pinus pinaster）体胚形成的过程中发现，体胚形成的数量与5-azac的浓度和处理的时间有关，当5-azac的浓度为10和15µmol/L时，体胚形成率最高［35］。欧洲的油菜（Brassica napus）和大麦（Hordeum vulgare）体胚诱导过程中发现，用2.5µmol/L 5-azac处理4d能显著提高体胚的诱导率［36］。对可可体胚发生潜能与基因组甲基化水平的关系进行分析，结果表明基因组甲基化水平随着继代时间的延长而升高，当可可体胚中基因组甲基化水平较高时，其诱导胚胎发生的能力降低，当使用5-azac处理后诱导效果明显增强［37］。Xu等［38］以柑橘愈伤组织为材料，设置不添加5-azac、添加5-azac和处理恢复组，通过分析发现，DNA甲基化抑制剂5-azac造成全基因组的去甲基化效应；吕晓婷等［39］在苹果愈伤组织形成过程中DNA甲基化的研究中发现，低浓度的5-azac对苹果愈伤的形成没有显著的影响，100µmol/L 5-azac浓度处理后苹果愈伤组织提前3 d形成，高浓度的5-azac浓度处理后外植体干枯死亡；Santos等［29］分析5-azac与蒺藜苜蓿体细胞胚胎发生DNA甲基化水平的关系，发现100µmol/L的5-azac能抑制体细胞胚胎发生，说明体细胞胚胎发生需要一定水平的DNA甲基化。本实验室前期的研究发现，采用0.1 mg/L 2，4-D黑暗处理20 d，龙眼胚性愈伤组织能发育形成球形胚。而本研究发现，不同浓度5-azac与0.1 mg/L 2，4-D黑暗处理18 d，与对照组相比随着5-azac浓度的增加，龙眼球形胚更典型，数量更多，且当5-azac浓度为25µmol/L时球形胚最典型、数量最多，继续增加5-azac的浓度，未产生球形胚，但当5-azac浓度为25µmol/L时，显著提高DlAGO4的相对表达量；不同浓度的5-azac与0.5 mg/L 2，4-D黑暗处理18 d，只 有5-azac的浓度为5µmol/L处理组中有球形胚产生，在此处理下DlAGO4的相对表达量显著上升。因此，龙眼球形胚的产生是一个DNA甲基化水平降低的过程，DlAGO4在龙眼球形胚产生过程中发挥了重要的作用。

3.2 5-azac抑制2，4-D的作用，促进龙眼早期体胚的发生

植物激素，特别是2，4-D，通过S-腺苷甲硫胺酸（SAM）或S-腺苷半胱胺酸（SAH）的积累或消失来改变植物全基因组的甲基化水平，2，4-D能够提高基因组的甲基化水平，而5-azac为甲基化抑制剂，因此，二者具有拮抗的关系［40-41］。在胡萝卜体胚发生的过程中用20.5µmol/L 5-azac和4.52 mmol/L 2，4-D处理24 h培养14 d，其体胚发生率与添加4.52 mmol/L 2，4-D一样，但是如果只用20.5µmol/L 5-azac处理24 h，培养3 d后发现其体胚的形成受到了严重的影响［42］。在南瓜（Cu‐curbita pepo）体胚发生过程中添加12.3µmol/L 5-azac和一定浓度的2，4-D，胚胎早期细胞系的DNA甲基化水平降低而原胚细胞系的甲基化水平并没有降低［34］。因此，在添加5-azac和2，4-D的MS培养基中，与在相同培养基中添加5-azac相比，不同阶段的胚胎比例没有发生显著变化。但是，用200µmol/L 2，4-D和50µmol/L 5-azac处理斐济果（Acca sellowiana）胚性愈伤组织，发现2，4-D和5-azac配合使用能降低体胚的全基因组甲基化水平，提高体胚的诱导［43］，因此，2，4-D与5-azac对不同植物体胚发生的作用具有异同性。本实验室前期研究发现，在MS培养基和添加0.1 mg/L 2，4-D的MS培养基中均能诱导球形胚的产生，只是诱导天数不一样，前者需要12 d，后者需要20 d。本研究发现，一定浓度的5-azac能促进龙眼球形胚产生，在2，4-D浓度为0.1 mg/L的培养基中，5-azac浓度为5µmol/L促进效果最佳，在2，4-D浓度为0.5 mg/L的MS培养基中添加5µmol/L 5-azac，有球形胚产生。因此，推测，一定浓度的5-azac能诱导龙眼球形胚的产生。

3.3 龙眼DlAGOs可能参与RNA介导的DNA甲基化机制

拟南芥AGO蛋白参与介导mRNA的剪切、转录抑制或DNA的甲基化修饰，不同成员功能各异或部分冗余，其中，AtAGO1、AtAGO4和AtAGO7被证明具有切割活性，分别与21-nt sRNA、24-nt sRNA和tasiRNA等不同类型sRNA结合，拟南芥AtAGO4、AtAGO6和AtAGO9存在功能上部分冗余，介导转录水平的基因沉默（TGS），AtAGO4主要与24 nt的小RNA结合［13］。通过对龙眼体胚发生过程小RNA组学测序发现，龙眼体胚small RNAs（sRNS）的长度以22～24 nt为主，其中24 nt的序列最多［44］。本研究发现，0.1、0.5 mg/L分别与5µmol/L的5-azac配合使用均促进了龙眼球形胚的产生，同时提高了DlAGO4的相对表达量。本研究推测，龙眼DlA‐GO4主要与24-nt sRNA结合，参与介导龙眼体胚发生过程RNA介导的甲基化机制，在龙眼球形胚的发生过程中发挥着重要的作用。