孙海燕 杨 靖 赵元增

（河南科技学院 新乡453003）

丹参（Salvia miltiorrhiza）又名赤参、紫丹参、红根等，是唇形科多年生草本植物，以根及根茎入药，是我国传统的中药材，在治疗心血管疾病、抗癌、抗衰老方面具有良好效果[1]。丹参的活性成分为脂溶性的丹参酮类和水溶性的酚酸类两大类化合物，被制成片剂、注射剂等；通过化学方法提取的有效成分丹参素、原儿茶醛和丹酚酸制成的用于冠心病、心绞痛预防和治疗的复方丹参滴丸[1-3]，在1997年就通过美国FDA的新药临床研究审评，在临床上具有广泛的应用。近些年来，作为医药工业的重要原料，丹参药材的消耗量日益增大，野生丹参资源已远远不能满足市场需求。因此丹参的人工种植和栽培越来越受到重视，丹参的产业化进程不断加快[2]。研究实践发现，在丹参的种植过程中使用传统的根段进行繁殖，长期的营养繁殖容易使病毒病传播导致丹参品质退化，培养出来的丹参品质良莠不齐，难以满足生产需要[4-5]；丹参芦头繁殖，出苗时间缓慢，一般需要60～75 d，如遇不良气候因素，会出现烂根，出苗率一般只有10%～15%[6]。因此，为能在短期内获得大量的健壮丹参种苗，本试验从2019年11月开始到2020年11月结束，历时1年时间，以丹参种子为材料，应用组织培养技术，建立了丹参的快速繁殖体系，包括丹参种子引发处理、无菌体系建立、丹参增殖培养基及生根壮苗培养基筛选。同时利用统计学中的单因素方差分析对结果进行分析，完善了丹参组培快繁技术体系，为大批量生产丹参优质种苗提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

丹参种子由河南科技学院生命科技学院生物技术实验室提供。

1.2 丹参种子的引发处理

挑选籽粒饱满的丹参种子放入纱布袋中用自来水冲洗干净，之后用12.5 mg/L的6-BA溶液在25℃恒温培养箱中浸种2 h[7]。

1.3 丹参无菌体系的建立

1.3.1 丹参种子表面灭菌 在超净工作台中将经过6-BA溶液引发处理的丹参种子（在纱布袋内）用适量75%酒精初步灭菌30 s，倒掉酒精加入0.1%HgCl2溶液灭菌7 min，之后倒掉HgCl2溶液，用无菌水冲洗4次，每次1～2 min，以确保完全冲洗掉种子表面残留的HgC12溶液。

1.3.2 丹参种子的接种与培养 ①无菌接种：在超净工作台中将表面灭菌后的丹参种子接种于盛有1/2MS培养基的培养瓶中，每瓶接种10颗种子并使种子均匀分散至培养基中。②培养：将接种好的丹参种子置于培养室的培养架上，光照度1 000～2 000 lx、光照时间12 h、温度25℃条件下培养17 d。

1.3.3 丹参无菌苗扩繁 以MS培养基为基本培养基，添加不同浓度配比的激素，不同处理见表1。将“1.3.2”中接种17 d后萌发的丹参种子的幼芽，分别接种到不同处理的培养基中，每瓶接种3棵幼苗，并使其均匀分散至培养基中，在瓶壁外标记好不同处理和接种日期。将接种好的丹参幼苗置于培养室，温度25℃、光照度2 000～3 000 lx条件下培养30 d，以获得大量无菌苗，建立丹参苗无菌体系[8]。

表1 丹参无菌苗扩繁培养基不同激素浓度配比处理

1.4 丹参增殖培养基的筛选

为优化丹参苗的快速增殖方法，以初步扩繁的丹参无菌苗为试验材料，以MS培养基为基本培养基，通过添加NAA和6-BA并设置不同浓度配比，不同处理见表2。

表2 丹参增殖培养基处理分组

截取丹参无菌幼苗顶芽，分别接种到上述不同处理的培养基上，每个处理接种15瓶，每瓶接种3棵。将接种好的丹参幼苗置于培养室，培养条件同“1.3.3”，培养30 d，每天观察丹参无菌苗的生长情况。30 d后统计诱导出的不定芽数量，并计算增殖系数。增殖系数=总苗数/接种苗数。

结果观察：统计丹参无菌苗叶片生长状态、增殖芽的数量及形态等性状。

1.5 丹参生根壮苗培养基的筛选

以“MS+蔗糖（3%）+琼脂（0.44%），pH 5.8”培养基为基本培养基，通过添加NAA和IBA 2种激素，进行生根壮苗培养。不同试验处理设置见表3。

表3 丹参生根壮苗培养基不同激素处理

选取长势整齐一致的丹参无菌苗分别接种到上述不同处理的培养基中，每个处理接种10瓶，每瓶接种3棵。将接种后的丹参幼苗置于培养室，培养条件同“1.3.3”，并每天观察丹参无菌苗的生长情况，于20 d后统计根数、株高及根粗，并计算生根率。生根率=生根苗数/总苗数。

结果观察：用刻度尺测量丹参无菌苗的株高和根长，统计丹参无菌苗的枯叶数、叶片的状态、根的状态等性状。

1.6 试验数据分析

通过Excel和SPSS软件对试验数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同植物生长激素种类及配比对丹参增殖的影响

在不同NAA和6-BA浓度配比的MS培养基上，丹参增殖与生长状况见表4。

由表4可知，各增殖培养基处理与对照相比，其增殖系数均大于对照处理，且添加细胞分裂素6-BA的各处理（除处理1外）均与对照有显著差异；单添加生长素NAA的2个处理与对照的增殖系数相比没有显著差异性。说明细胞分裂素6-BA在促进丹参幼苗增殖中起到了良好的增殖效应。

表4 不同NAA/6-BA浓度配比对丹参增殖的影响

处理1、处理2和处理3各培养基配方中，均添加了相同低浓度的NAA（0.02 mg/L），6-BA的添加浓度依次递增，增殖率均有所提高，这3个处理间没有显著差异，但处理2和处理3与对照均有显著差异；处理4、处理5和处理6各培养基配方中，在处理1～处理3的基础上，提高了生长素NAA（0.04 mg/L）的浓度，处理5的增殖系数为所有处理中最高；此结果说明适当的NAA/6-BA浓度配比能显著提高丹参的增殖率。但随着2种激素的共同添加，处理1～处理6中各丹参幼苗均表现出不同程度的玻璃化现象。但在处理8～处理10中，添加了相应浓度的6-BA，均未添加NAA，幼苗几乎没有玻璃化现象，说明NAA的添加对丹参增殖有促进作用的同时也易导致丹参幼苗玻璃化。

处理8～处理10培养基中只添加了6-BA，6-BA的浓度依次增加，其增殖率较对照相比均有提高，且处理8～处理10培养基中丹参的增殖系数与对照有显著差异性；处理11～处理12培养基中只添加了NAA，没有显著提高丹参苗的增殖率。处理8～处理12丹参幼苗在培养过程中基本没有玻璃化现象出现。

玻璃化对后期组培幼苗的生长影响较大，且造成的损害基本是不可逆的。在本试验的各处理中，处理5的增殖系数最大，但增殖幼苗出现了较严重的玻璃化，且芽和叶片非常小，呈簇生状，不利于后期培养；同时，增殖系数较高的处理3、处理2和处理6也有不同程度的玻璃化现象，因此不选为增殖的最佳培养基。

综合各种因素，本试验选出MS+6-BA（0.2 mg/L）（处理8）为丹参幼苗增殖的最佳培养基。在此培养基中，丹参幼苗增殖系数大，没有玻璃化现象，幼苗叶片大，枯叶少，幼苗整体生长健壮。

2.2 不同植物激素种类及浓度对丹参生根壮苗的影响

NAA和IBA都是植物组织培养中常用的植物生长激素，它们能够促进植物根的分化，但促进植物生根的效果常因植物种类的不同而存在差异。在不同NAA和IBA浓度的各培养基上，丹参生根壮苗状况见表5。

表5 不同激素种类及浓度对丹参生根壮苗的影响

在所有处理的培养基中，丹参的生根率均较高，但不同处理生根数量及根的粗细明显不同。说明丹参幼苗容易生根，但要获得大量粗壮的根需添加适合的生长素进行调节，以更好促进根的分化。

添加NAA各处理中丹参生根状况均比添加IBA处理的生根状况好，此结果表明，在促进丹参根的分化中，NAA的作用要优于IBA；在添加NAA的各处理中丹参株高的增长也比只添加IBA的处理效果好。

在添加NAA的各培养基中，MS+NAA（0.01 mg/L）（处理2）生根率不高，根数量较多，但根多为很细的须状根；MS+NAA（0.02 mg/L）（处理3）生根率最高，诱导出根的数量较多且最粗壮，根长也比较适中，整体植株长势最好；MS+NAA（0.05 mg/L）（处理4）和MS+NAA（0.2 mg/L）（处理5）根的数量较少。 此结果表明，培养基中低浓度的NAA促进根的分化和生长，高浓度的NAA添加则不利于根的生长。

添加0.02 mg/L NAA的培养基中生根率和根的数量均优于其他处理，且在此培养基中根生长得最粗壮且根长适中，整体植株长势最好，为丹参生根壮苗的最佳培养基。

3 结论与讨论

本试验以丹参种子为材料，通过升汞溶液表面灭菌，种子无菌接种及引发剂诱导萌发等试验环节，获得了一定量的丹参无菌幼苗，为下一步的丹参无菌快繁体系建立准备了充足的试验材料；通过不同NAA和6-BA浓度配比的培养基设置，筛选出最佳的增殖培养基为MS+6-BA（0.2 mg/L）+蔗糖（3%）+琼脂（0.44%），pH 5.8，在此培养基中，丹参无菌幼苗增殖系数高，叶片较大，颜色嫩绿且无枯叶，整体增殖和生长状况好；在丹参无菌幼苗增殖的基础上，进行了生根壮苗培养，分别在MS基本培养基中添加不同浓度的NAA和IBA，发现NAA对丹参幼苗生根壮苗效果较好，筛选出最佳生根壮苗培养基为MS+NAA（0.02 mg/L）+蔗糖（3%）+琼脂（0.44%），pH 5.8，在此培养基中，丹参幼苗的生根率和根的数量较多，且根生长粗壮，植株生长良好，有利于后期的大田移栽。

丹参幼苗在增殖的过程中，要选用适当激素种类及合适浓度配比的培养基；如果用激素浓度较高的培养基，尤其是添加了生长素NAA培养基，容易引发幼苗玻璃化；6-BA浓度高，增殖率高，但生成的幼苗较小，叶片小，呈簇生状，无效苗较多，不利于后期培养。在本研究中最佳的增殖培养基为MS+6-BA（0.2 mg/L）+蔗糖（3%）+琼脂（0.44%），pH=5.8，这与解晓红等的“在MS+6-BA（1.0 mg／L）+NAA（0.5 mg/L）的培养基中使丹参无菌苗的顶芽增殖出大量的不定芽[5]”研究结论有差异，分析原因可能与在试验中采用不同品种的丹参材料有关[7]。

孟倩等以丹参的叶片为外植体、以不同种类和浓度的植物生长调节剂对丹参根诱导进行的试验验证结果表明，1/2MS+NAA（0.5 mg/L）的培养基配方为诱导丹参无菌苗生根的最适培养基配方[8]。在本研究中丹参无菌苗生根壮苗效果最好的培养基配方为MS+NAA（0.02 mg/L）。与相关文献结论有差异，但相同之处都是NAA这一植物激素对丹参无菌苗的生根诱导效果最佳，只是浓度上的差异。分析原因可能与在试验中采用不同品种的丹参材料有关，也可能是因为选用的基本培养基不同所致[7]。