胡梓妍，刘 伟，何 双，胡小琴，张菊华,,*，单 杨,3,*

（1.湖南大学研究生院隆平分院，湖南 长沙 410125；2.湖南省农业科学院农产品加工研究所，湖南 长沙 410125；3.湖南省农业科学院，湖南 长沙 410125）

金橘是柑橘属中体型较小，并且能连皮食用的水果，现代医学证明它具有软化血管、治疗高血压、调节生理功能紊乱的功效[1-2]，主要分布在江西遂川、浙江宁波、湖南浏阳、广西融安及阳朔、福建尤溪等地[3]。同时，金橘是许多营养物质的来源，富含维生素、胡萝卜素、果胶、钙、磷、铁和类黄酮[4-5]。

水果的香气能反映不同水果的特性，并直接影响新鲜水果和加工过的水果产品的感官品质[6]，是评价果品食用价值和商品价值的重要指标。它由多种挥发性化合物（volatile organic compounds，VOC）组成的复杂混合物构成，在植物生长过程中不断变化，并且通过多种生化途径（如新陈代谢转化为分解代谢），由大量非挥发性植物前体形成挥发性化合物[7-8]。柑橘果实中的VOC达到一百多种，主要包括萜类化合物、醇、醛和酸[9]，其中萜类化合物是柑橘果实中最重要的挥发性成分[10]。VOC的组成与含量不仅影响水果的香气和感官特性，还有许多其他用途。例如Zhang Haipeng等[9]通过主成分分析（principal component analysis，PCA）证明不同种类的柑橘可以通过鉴别VOC完全区分，有30 种VOC可作为区分宽皮柑橘、甜橙、柚子和柠檬的潜在生物标记物。芳香活性化合物还可以用于区分水果生产区域[7]。Simeone等[11]检测了4 种柠檬不同成熟阶段的理化性质及生物活性化合物，结果表明，不同品种和不同成熟阶段的柠檬，其VOC均有不同表现。其中，单萜的变化主要发生在果实发育早期，而柠檬烯可能在成熟阶段发生酶促降解。在酸橙的挥发性成分中，α-萜品醇、α-萜品烯和γ-萜品烯对心血管活性具有恢复抗氧化酶活性的能力，而柠檬烯、芳樟醇和4-萜品醇在预防心血管疾病和和高血压方面是有益的[12]。Wang Yongwei等[13]分析了从金橘中分离的VOC成分，并对其抗菌性能进行了检测，发现金橘的VOC成分对细菌（革兰氏阴性和革兰氏阳性）和真菌（白色念珠菌）均显示出广泛的抗菌活性。重要的是，其对食源性病原菌尤其是蜡状芽孢杆菌具有抑制作用。

与柑橘类其他水果不同的是金橘可以连皮食用，因此VOC的组成和含量是影响其质地、风味和味道的重要因素[14]。在金橘的VOC中，萜烯是最主要的化合物，其中(d)-柠檬烯是最丰富的化合物，其比例高于其他柑橘类水果，例如柚子（78%）、柠檬（65%）、青柠（52%）、宽皮柑橘（86%～90%）、橙子（88%～90%）和夏橙（80%～82%）[15]。早期对于金橘的研究，主要集中在金橘提取物的抗氧化性和抗菌性能[13,16-18]，近年来，顶空固相微萃取-气相色谱-质谱（headspace solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）广泛应用于检测水果的VOC，具有方便快捷、灵敏度高、选择性与重复性好的特点，能较真实地反映水果样品挥发性物质的基本组成[19]。因此，本实验通过优化HSSPME-GC-MS条件，对不同产地的3 种金橘样品进行检测，通过PCA和层次聚类分析，旨在为进一步研究金橘的风味和品质提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

浏阳金弹由湖南省浏阳市金橘合作社提供；融安油皮金橘和阳朔脆皮金橘由湖南省长沙市大鲜果园提供。将样品洗净晾干后，去核并粉碎，存于-80 ℃冰箱备用。

环己酮、氯化钠（均为分析纯） 生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 仪器与设备

7890A-5975C型GC-MS联用仪、DB-5石英毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 美国Agilent公司；SPME装置、50/30 μm二乙烯基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）萃取头、65 μm DVB/PDMS萃取头、85 μm CAR/PDMS萃取头 美国Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 单因素试验

选择对金橘挥发性成分影响较大的不同涂层SPME纤维萃取头、萃取温度、萃取时间、样品质量以及解吸时间进行优化分析，以总峰面积作为考察指标进行单因素试验。

萃取头：准确称取3.0 g金弹样品于20 mL顶空进样瓶中，加入3 mL饱和氯化钠溶液和2 μL环己酮（内标物），用聚四氟乙烯隔垫密封瓶盖旋紧，上机检测。在保持萃取温度50 ℃、萃取时间50 min、解吸时间5 min及其他条件不变的情况下，对50/30 μm DVB/CAR/PDMS、65 μm DVB/PDMS、85 μm CAR/PDMS 3 种萃取头进行筛选。

萃取时间：保持萃取温度50 ℃、样品质量3.0 g、解吸时间5 min及其他条件不变的情况下，分别对萃取时间30、40、50、60、70 min进行考察，确定最优萃取时间。

萃取温度：在保持萃取时间50 min、样品质量3.0 g、解吸时间5 min及其他条件不变的情况下，分别对萃取温度30、40、50、60、70 ℃进行考察，确定最优萃取温度。

样品质量：在保持萃取温度50 ℃、萃取时间50 min、解吸时间5 min及其他条件不变的情况下，分别对样品质量2、2.5、3、3.5 g进行考察，确定最优样品质量。

解吸时间：在保持萃取温度50 ℃、萃取时间50 min、样品质量3.0 g及其他条件不变的情况下，分别对解吸时间3、4、5、6 min进行考察，确定最优解吸时间。

1.3.2 响应面优化试验

在单因素试验基础上，进一步对萃取温度、萃取时间和样品质量进行响应面分析。应用Box-Behnken试验设计原理，以总峰面积为响应值，进行3因素3水平响应面试验（表1），确定HS-SPME-GC-MS分析金橘香气成分的最佳条件。

表1 响应面试验因素与水平Table 1 Factors and levels used for Box-Behnken design

1.3.3 GC-MS条件

GC条件：DB-5色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升温程序：35 ℃保持5 min，以3 ℃/min升至180 ℃，保持2 min，再以5 ℃/min升至240 ℃，保持2 min；进样口温度250 ℃；不分流进样；载气为氦气（纯度＞99.999%）；载气流速1 mL/min。

MS条件：电子电离源；电子能量70 eV；传输线温度280 ℃；离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；质量扫描范围m/z35～400。

1.3.4 挥发性化合物定性和半定量分析

GC-MS实验数据由系统自带软件处理，金橘样品的挥发性成分通过与计算机商业谱库NIST 2011比对，仅保留匹配值在80以上的挥发性成分。

本实验中鉴定分析并非绝对含量，而是相对于内标物的相对含量，主要通过总离子流图各峰的峰面积定量分析，每个样品重复3 次，含量以μg/g表示。

1.3.5 气味活度值（odor active value，OAV）计算

按下式计算OAV，OAV不小于1的化合物被确定为金橘中的活性香气化合物。

式中：Ci为金橘挥发性成分的含量/（μg/g）；OTi为挥发性成分i在水中的香气阈值/（μg/g）。

1.4 数据处理

SPSS 22.0软件用于样本间的显著性差异分析和PCA，Origin 2017软件作图。聚类分析使用R语言。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 萃取头对萃取效果的影响

不同种类目标萃取物，需要不同类型的吸附质涂层萃取[20]。由图1可知，DVB/CAR/PDMS萃取头得到的总峰面积最大（是其他2 种萃取头的2 倍）且误差相对较小，萃取效果最佳，而CAR/PDMS萃取头和DVB/PDMS萃取头得到的总峰面积一样。因此，选取DVB/CAR/PDMS型号萃取头。

图1 萃取头对VOC萃取效果的影响Fig. 1 Effect of extraction fiber on the extraction efficiency of VOCs

2.1.2 萃取时间对萃取效果的影响

待测物在萃取头涂层与气相之间的平衡需要时间[21]。如图2所示，随着萃取时间的延长，总峰面积呈现先升后降的趋势，在60 min达到最高。在其他条件不变的前提下，SPME纤维头在顶空瓶内达到吸附与解吸的动态平衡时有最大吸附量[22]，说明在60 min时，金橘VOC的吸附与解吸已达到动态平衡，而随着时间延长，VOC解吸导致了总峰面积的下降，因此确定最佳萃取时间为60 min。

图2 萃取时间对VOC萃取效果的影响Fig. 2 Effect of extraction time on the extraction efficiency of VOCs

2.1.3 萃取温度对萃取效果的影响

萃取温度对萃取效果的影响主要是通过影响样品在三相间的分配系数和扩散系数实现[23]。由图3可知，温度升高，样品的扩散系数增大，扩散速度随之增大，而高温容易降低纤维头吸附挥发物质的能力，不利于对样品的吸附。由图3可知，随着萃取温度的升高，总峰面积不断增加，在50 ℃时达到最高，随着温度的继续升高，总峰面积开始显著下降，因此将50 ℃确定为最佳萃取温度。

美国国立卫生研究院基金要求遵守的相关要求和条款包括立项通知书中规定的相关条款和特别条款、联邦基金相关法案的条款、《美国国立卫生研究院资助政策声明》的相关要求和条款。

图3 萃取温度对VOC萃取效果的影响Fig. 3 Effect of extraction temperature on the extraction efficiency of VOCs

2.1.4 样品质量对萃取效果的影响

萃取瓶的容量固定，样品质量太少则挥发性物质太少而不易分析，样品质量太多，则容易造成挤压导致气体不易挥发出来[20]。由图4可知，随着样品质量的增加，总峰面积先呈现上升的趋势，当样品质量达到3.0 g时，总峰面积达到最高，之后开始显著降低。原因是样品质量影响样品瓶中气相和液相的体积比，影响香气物质在两相的分配比[24]。同时，当样品质量过多，会导致预热时受热不均匀，影响萃取效果[25]。因此最佳样品质量确定为3.0 g。

图4 样品质量对VOC萃取效果的影响Fig. 4 Effect of sample mass on the extraction efficiency of VOCs

2.1.5 解吸时间对萃取效果的影响

解吸时间越长，萃取的物质越多，但也可能会导致萃取头上的物质分解，影响萃取结果[26]。由图5可知，随着解吸时间的延长，总峰面积先呈现上升趋势，在5 min时达到最高值，之后随着解吸时间继续延长，总峰面积呈现下降趋势。原因可能是时间太短，解吸附不够，时间过长，进样口温度高导致部分VOC分解。因此，确定最佳解吸时间为5 min。

图5 解吸时间对VOC萃取效果的影响Fig. 5 Effect of desorption time on the extraction efficiency of VOCs

2.2 响应面试验优化分析

表2Box-Behnken试验设计与结果Table 2 Box-Behnken design in terms of coded data with total peak area as response variable

试验设计及结果见表2。利用Design-Expert对试验数据进行多元回归分析，得到回归拟合方程如下：Z＝4.39-0.56A+0.25B+0.26C-0.28AB+0.13AC-0.10BC+0.024A2-0.14B2-0.066C2。

对上述二次回归方程进行方差分析，由表3可以看出，萃取温度对结果影响极显著（P＜0.01），模型显著（P＜0.05），失拟项不显著（P＞0.05），表明所建立的模型可用于金橘中VOC总峰面积的分析。根据F值大小，各因素对金橘VOC总峰面积的影响程度为萃取温度＞样品质量＞萃取时间。

表3 回归模型方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

图6 各因素交互作用对金橘VOC总峰面积影响的响应面Fig. 6 Response surface and contour plots showing the interactive effect of various factors on total peak area of VOCs in Kumquats

为了确定响应面法所得结果的可靠性，利用Design-Expert软件进行分析，得到最佳金橘VOC检测条件为萃取温度40 ℃、萃取时间70 min、样品质量3.0 g，预测金橘挥发性物质峰面积为5.4×1010。以此条件重复3 次实验，得金橘挥发性物质峰面积为5.1×1010，与理论预测值相差较小，表明该响应面回归模型具有可行性。

2.3 3 种金橘中挥发性化合物分析

在HS-SPME-GC-MS最优条件下，分别对浏阳金弹、融安油皮金橘和阳朔脆皮金橘进行检测，结果见表4。共得到76 种挥发性成分，主要有6大类，分别为49 种萜烯、11 种醇类、5 种醛类、4 种酯类、3 种酮类、4 种烷烃类。其中，浏阳金弹检测出62 种VOC，阳朔脆皮金橘58 种，融安油皮金橘48 种。在3 种金橘样品中含量较高的挥发性化合物有(d)-柠檬烯（1 188.56～3 952.03 μg/g），其次是月桂烯（67.08～380.77 μg/g）、D-大根香叶烯（18.08～103.53 μg/g）、β-榄香烯（12.70～53.98 μg/g）、芳樟醇（21.55～39.67 μg/g）和乙酸香叶酯（85.14～119.66 μg/g）。除了乙酸香叶酯在融安油皮金橘中未检测到之外，其余5 种挥发性成分是他们的共有成分。(d)-柠檬烯、月桂烯和D-大根香叶烯在3 种金橘中相对含量差异显著，在阳朔脆皮金橘中相对含量最高，其次是浏阳金弹，在融安油皮金橘中相对含量最小。β-榄香烯在阳朔脆皮金橘和浏阳金弹中相对含量差异不显著。芳樟醇在浏阳金弹中相对含量显著高于阳朔脆皮金橘。研究结果与相关文献报道基本一致[14,27-28]，但并不完全符合，这可能是因为品种、成熟度及产地差异所致。

3 种金橘共有的VOC有35 种，不同产地金橘都具有独特的VOC成分。浏阳金弹所特有的VOC有香树烯、4-异丙基-1,6-二甲基-1,2,3,7,8,8a-六氢萘、4-蒈烯、α-芹子烯、(-)-马兜铃烯、(E)-(+)-异柠檬烯、香芹醇和(+)-二氢香芹酮。阳朔脆皮金橘特有的VOC有2-蒈烯、(E)-菖蒲萜烯、十二醛、十一烷和8-异亚丙基双环[5.1.0]辛烷。融安油皮金橘特有的VOC有(2E,4E,6E)-3,4-二甲基-2,4,6-辛三烯、氧化柠檬烯、佛术烯、β-愈创木烯、β-萜品烯、β-罗勒烯和二氢香芹酮。

表4 HS-SPME-GC-MS鉴定的3 种金橘成分及其含量Table 4 Contents of aroma compounds in three kumquat varieties identified by HS-SPME-GC-MS

续表4

与其他柑橘类水果相同，萜烯类化合物是金橘中最丰富的成分。通过VOC浓度除以感官阈值计算每种化合物的OAV。当OAV大于1时，OAV与香气化合物对整体香气的贡献呈正相关。当OAV小于1时，香气化合物起负作用[7]。由表5得出，所测金橘中共有23 种风味化合物OAV大于1。值得注意的是，萜烯类化合物种类减少，反而包含了许多醇类、醛类和酯类，这与已报道的研究相符[25]。(d)-柠檬烯虽然是柑橘类水果挥发性成分中最丰富的化合物，但对它们香气的影响并不大[29]。反而低浓度的化合物，特别是醛和酯，对柑橘类水果的风味影响更大[30]。OAV大于1 000的有月桂烯（天竺葵味）、(d)-柠檬烯（柑橘，柠檬，薄荷味）、芳樟醇（花香，果香，甜味）、癸醛（柑橘，青草味，脂肪味）和紫苏醛（青草味，油脂味）。OAV大于100的有(Z)-β-罗勒烯（植物的味道）、α-蒎烯（松木香）、己醛（青草香，肥皂味）、叶醛（青草香）、乙酸香叶酯（柠檬，玫瑰和薰衣草香）和(d)-香芹酮（薄荷香）。

表5 金橘中VOC的OAVTable 5 OAVs of VOCs detected in kumquats

在浏阳金弹中，芳樟醇和紫苏醛的OAV明显大于其他2 种金橘，这2 种化合物表达出花香，果香和油脂的味道。表5显示，对浏阳金弹香气贡献最大的是月桂烯、(d)-柠檬烯、芳樟醇和癸醛，表达出柑橘、薄荷的香气。而总体来说，大部分香气活性成分在阳朔脆皮金橘中的OAV相比另外2 种金橘更大，有月桂烯、(d)-柠檬烯和癸醛等。阳朔脆皮金橘中独特的香气活性成分有月桂醛，这种化合物表达出柑橘油脂香和松叶油脂香。相比前2 种金橘，融安油皮金橘突出的香气活性物质为月桂烯、(d)-柠檬烯、芳樟醇和己醛，其含有的独特成分是氧化柠檬烯，表达出花香和甜香。

2.4 3 种金橘中挥发性化合物的PCA

对表5化学物质按各自类别进行编号后（Z1～Z23），采用SPSS 22.0软件进行PCA。共提取3 个主成分，累计贡献率为97.1%，其中PC1贡献率62.5%，PC2贡献率30.2%，累计贡献率92.7%，前2 个PC已经包含金橘香气的绝大部分信息量（表6）。如图7所示，3 种金橘具有明显的区域分布。阳朔脆皮金橘在PC1上得分最高，这表明在PC1上有较高载荷的VOC如Z1、Z2、Z3、Z7、Z8和Z20等，在阳朔脆皮金橘中含量较高。浏阳金弹在PC2上得分最高，而在PC1上的分很低，因此在PC2上载荷较高的VOC如Z7、Z11、Z15、Z19、Z23，在浏阳金弹中含量较高，而在PC1上载荷较高的VOC在浏阳金弹中含量较低。而融安油皮金橘在PC1和PC2上的得分都很低，位于第3象限，分布在第3象限的挥发性成分Z9、Z14、Z16在融安油皮金橘中含量较高。

图7 不同品种金橘的挥发性成分的PCAFig. 7 PCA score scatter and loading plots of volatile components in different varieties of kumquat

表6 5 个PC的特征值及其贡献率Table 6 Eigenvalues, contribution rates and cumulative contribution rates of first five principal components

2.5 3 种金橘中挥发性化合物的聚类分析

为了进一步确认金橘样本之间的差异，对表5中的化学物质（Z1～Z23）进行聚类分析。如图8所示，可以更加明显区分3 种金橘。结果表明，浏阳金弹和阳朔脆皮金橘中VOC有部分高度相似，例如α-石竹烯、(Z)-β-罗勒烯、癸醛和乙酸香叶酯等。α-蒎烯、芳樟醇、α-松油醇和(d)-香芹酮等对浏阳金弹有更好的辨别能力，可作为浏阳金弹的特征性组分。而异松油烯、月桂醛、叶醛、月桂烯和乙酸橙花酯等在浏阳金弹和融安油皮金橘中得分低甚至不存在，但在阳朔脆皮金橘中得分高，可作为区别其他2 个品种的目标物质。融安油皮金橘的香气与氧化柠檬烯、橙花醇和己醛等显著相关，能作为目标物质区分融安油皮金橘与其他2 个品种。结果证明，通过聚类分析能将3 个品种完全区分。上述结果与PCA结果一致。

图8 不同品种金橘的挥发性成分聚类分析热图Fig. 8 Heat map from cluster analysis of volatile components in different varieties of kumquat

3 结 论

本研究采用HS-SPME-GC-MS分析3 种金橘的香气成分，共鉴定出6 类物质共计76 种香气成分。结果表明，(d)-柠檬烯、月桂烯、D-大根香叶烯、β-榄香烯、芳樟醇和乙酸香叶酯等是含量较丰富的香气成分。其中香树烯、4-蒈烯、α-芹子烯、(-)-马兜铃烯、(E)-(+)-异柠檬烯、香芹醇和(+)-二氢香芹酮等是浏阳金弹中的特有香气成分。阳朔脆皮金橘特有的香气成分有2-蒈烯、(E)-菖蒲萜烯、十二醛和十一烷等。融安油皮金橘中特有的香气成分有氧化柠檬烯、佛术烯、β-愈创木烯、β-萜品烯和β-罗勒烯等。

采用OAV法对3 种金橘的香气成分进行分析，有23 种香气成分的OAV大于1，其中OAV得分较高的是月桂烯、(d)-柠檬烯、芳樟醇、癸醛、紫苏醛、(Z)-β-罗勒烯、α-蒎烯和己醛等，这些物质对金橘的直接风味贡献较大。

总体来看，3 种金橘香气成分的含量、组成和特征香气均有一定的差异。通过PCA和聚类分析，3 种金橘的香气成分因产地和品种不同有所区别。研究结果可为金橘香气品质的科学评价以及通过香气成分追溯金橘产地和品种等提供重要科学依据，对于其中具体香气成分形成和转化的机理还有待进一步研究。