刘振云，左高隆,2，林 勇,2,3*

1. 湖南农业大学 茶学教育部重点实验室，湖南 长沙 410128；2. 国家植物功能成分利用工程技术研究中心，湖南 长沙 410128；3. 湖南省植物功能成分利用协同创新中心，湖南 长沙 410128

肥胖是一种全球性的健康问题。据报道，全球有约2.5亿人的生活受肥胖影响，其已被确定为全球第五大死亡危险因素[1]。肥胖的发病原因十分复杂，主要包括饮食失衡、运动匮乏、遗传和肠道屏障损伤等因素[1]。其中，高热量食物的摄入容易改变肠道菌群组成，导致宿主从饮食中获取更多能量从而增加体重[2]。此外，高脂食物的摄入还会增加肠道通透性并促进内毒素易位，引起机体慢性低度炎症和氧化损伤[3]，“肠-脂肪”信号轴已成为防治肥胖的潜在靶点[4]。但是，当前针对肥胖症的安全高效药物十分紧缺，寻求能防治肥胖的植物资源及有效成分已逐渐成为科学家们研究的热点。茶是药食兼用的植物资源，大量研究表明茶叶具有降脂减肥、调节肠道菌群、修复肠粘膜机械损伤、维持肠道稳态等多种功效[5-6]。表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）作为绿茶的主要活性单体成分，为茶叶诸多药理功能之首要成分[7]。先前的研究表明，EGCG能够通过激活AMPK信号通路以及调节脂肪代谢基因表达来降低体重和抑制脂肪蓄积[8-9]；此外，EGCG还可以通过改变高脂饮食小鼠肠道菌群组成达到降低体重的目的[10]。我们以前的实验结果也表明，EGCG对高脂饮食大鼠具有明显的调脂保肝作用[11]。然而，EGCG对肥胖大鼠的肠道屏障损伤的保护作用未见报道，相关降脂减肥的潜在机制也尚未完全阐明。基于此，本文从“肠-脂肪”信号轴角度，通过体重、脏器指数、脂肪和肠道病理情况、炎症因子、内毒素水平等指标分析，探究EGCG对肥胖大鼠肠黏膜屏障损伤的改善作用并阐释相关降脂减肥的可能机制。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 EGCG样品

购自sigma公司，纯度≥98%。

1.1.2 试验动物及饲料

Sprague-Dawley（SD）大鼠，雄性，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，体质量为（100±20）g，生产许可证号：SCXK（湘）2016-0002。高脂饲料的配制参照《保健食品检验与评价技术规范 辅助降血脂功能评价方法》（2012年修订），配方为基础饲料63.6%、蔗糖20.0%、猪油15.0%、胆固醇1.2%、胆酸钠0.2%。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 试剂

总胆固醇（Total cholesterol，TC）、甘油三酯（Triglyceride，TG）、低密度脂蛋白胆固醇（Low density lipoprotein cholesterol，LDL-c）、高密度脂蛋白胆固醇（High density lipoprotein cholesterol，HDL-c）、谷丙转 氨 酶（Alanine aminotransferase，ALT）、谷草转氨酶（Aspartate transaminase，AST）及二胺氧化酶（Diamine oxidase，DAO）测定试剂盒购于南京建成生物工程研究所。肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor，TNF-α）和脂多糖（LPS）Elisa测定试剂盒购于卡迈舒（上海）生物科技有限公司。

1.2.2 仪器

MIKRO 22R冷冻离心机（德国Hettich公司）、Modulyod-230冷冻干燥机（美国Thermo公司）、Thermo Scientific Varioskan Flash酶标仪（美国Thermo公司）、UV-2550紫外分光光度计（日本Shimadzu公司）、AEU-210湘仪电子天平（长沙湘仪天平仪器公司）、Allegra X-22R台式离心机（美国贝克曼公司）、移液枪（美国Thermo公司）、压力蒸汽灭菌锅（上海中安医疗器械厂）、病理切片机（上海徕卡仪器有限公司）、石蜡包埋机（武汉俊杰电子有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 动物模型的构建和给药标准

根据已有研究[11]，建立动物模型并确定给药标准。取体质量为（100±10）g的SPF级雄性SD大鼠，在温度（25±2）℃和湿度40% ～60%的环境中，提供基础饲料和饮用水供大鼠自由饮食。经过一周适应性饲养后，将大鼠随机平均分为4组（n = 8）：正常组、肥胖组、EGCG低剂量组（75 mg/kg）和EGCG高剂量组（150 mg/kg）。每日上午9时对EGCG组大鼠灌胃不同剂量的EGCG溶液，均用蒸馏水配置2 mL，正常组和肥胖组大鼠灌胃相同体积的蒸馏水。其中正常组大鼠喂食基础饲料，其余组大鼠喂食高脂饲料，共持续56 d。每7 d称取一次大鼠体重。最后一次灌胃后禁食不禁水24 h，将大鼠麻醉，主动脉取血，解剖收集附睾脂肪组织、空肠和结肠，迅速称重后于-80℃保存。

1.3.2 血清指标的测定

主动脉取血后，放入EP管中，在4℃静置2 h后，于4℃下3500 r·min-1离心15 min，取上清液。严格按照试剂盒说明书操作步骤检测血 清 TG、TC、HDL-c、LDL-c、ALT、AST、LPS、DAO和TNF-α含量。

1.3.3 器官指数测定

将大鼠各器官用4℃生理盐水洗净血渍，滤纸吸干表面水分后称其湿重。器官指数=器官湿质量（g）/大鼠体质量（g）×100%。

1.3.4 大鼠组织病理学观察

大鼠肝脏、脂肪和肠道病理切片制备：分别取每只大鼠肝脏、附睾脂肪、空肠和结肠组织的相同部位，在10%福尔马林液下固定，固定后经流水冲洗数小时。制备石蜡切片，H&E染色，显微镜下拍照观察。

1.3.5 大鼠空肠绒毛长度、隐窝深度和上皮间淋巴细胞数量测定

利用Caseviewer图像分析软件对大鼠的空肠绒毛高度和隐窝深度进行测定。每组随机选取4只大鼠的空肠H&E染色切片，每张切片选取2根形态结构完整的绒毛，计算绒毛长度/隐窝深度（Villus height/Crypt depth，V/C）的比值；统计绒毛上每100个空肠细胞间分布的上皮间淋巴细胞数量。

1.4 数据处理

采用SPSS 22.0统计软件对数据进行方差分析，统计结果以平均数±标准差（±s）表示。*P < 0.05表示存在显著性差异，**P < 0.01表示存在极显著性差异。

2 结果与分析

2.1 对肥胖症大鼠体重的影响

表1可看出，与正常组相比，肥胖组大鼠从第二周开始体重明显增加（P < 0.05或P <0.01）。与肥胖组相比，EGCG低、高剂量组大鼠从第三周开始体重均明显降低（P < 0.05或P< 0.01）。结果表明高脂饮食可以显著增加大鼠体重，而给药EGCG后可有效降低大鼠体重。

表1 EGCG对大鼠体重影响（n = 8）Table 1 Effect of EGCG on body weight of rats (n=8)

2.2 对肥胖症大鼠血脂代谢的影响

由表2可知，与正常组相比，肥胖组大鼠的血清TG、TC和LDL均显著增加，HDL显著降低（P < 0.01）。给药低剂量和高剂量EGCG后，肥胖大鼠的血清TG、TC和LDL水平均显著降低，HDL水平显著增加（P < 0.01），呈剂量依赖关系。表明高脂饮食会导致大鼠血脂代谢紊乱，而给药EGCG可有效改善高脂诱导的血脂代谢紊乱现象。

表2 EGCG对大鼠血清指标的影响（n = 8） （mmol/L）Table 2 Effect of EGCG on serum indexes of rats (n=8) （mmol/L）

2.3 对肥胖症大鼠体脂率和脂肪细胞的影响

图1A表明，与正常组相比，肥胖组大鼠的体脂率显著增加（P < 0.01）；与肥胖组相比，给药低、高剂量EGCG均能显著降低肥胖大鼠的体脂率（P < 0.01），并呈剂量依赖关系。此外，附睾脂肪组织H&E染色结果表明（图1B），正常组大鼠脂肪细胞排列规则，尺寸较小，无病理特征；肥胖组大鼠的脂肪细胞存在较严重的病变（炎细胞浸润现象如黑色箭头所示），且脂肪细胞肿大；给药EGCG后均能显著改善脂肪细胞病变现象并能够减少脂肪细胞尺寸。这些结果表明，高脂饮食会增加大鼠体脂率和脂肪细胞大小，并引起脂肪组织病变，而给药EGCG可有效降低肥胖大鼠体脂率和脂肪细胞大小，改善脂肪病变。

图1 EGCG对肥胖大鼠脂肪蓄积及炎症的影响（n = 8）Figure 1 Effects of EGCG on fat accumulation and inflammation in obese rats (n=8)

2.4 对肥胖症大鼠肠道通透性及炎症的影响

表3表明，与正常组大鼠相比，肥胖组大鼠血清LPS、DAO、TNF-α含量和空肠上皮间淋巴细胞数量均显著增加（P< 0.01）；在给药低、高剂量EGCG后，肥胖组大鼠血清LPS、DAO、TNF-α含量和空肠上皮间淋巴细胞数量均显著减少（P< 0.01），且呈剂量依赖关系。这些表明，高脂饮食会破坏肠道通透性，增加炎症状况，而给药EGCG可以减少肠道通透性，抑制炎症。

表3 EGCG对大鼠肠道通透性及炎症的影响（n = 8）Table 3 Effects of EGCG on intestinal permeability and inflammation of rats (n=8)

2.5 对肥胖症大鼠肠道病理损伤的影响

肠道H&E染色切片结果（图2和表4）表明，正常组大鼠空肠和结肠绒毛排列整齐、完整，无病理损伤现象；肥胖组大鼠空肠绒毛排列稀疏、断裂，有明显的炎细胞浸润现象且空肠V/C值较正常组显著降低（P< 0.01），结肠有水肿现象（如黑色箭头所示）；EGCG给药组大鼠空肠绒毛排列紧密、整齐，无断裂，空肠未产生炎细胞浸润现象且空肠V/C值较肥胖组大鼠显著增加（P< 0.01），结肠无水肿现象。这些表明，高脂饮食会增加破坏肠道稳态，造成肠道绒毛损伤，诱发炎症，增加肠道水肿，而给药EGCG可以有效保护高脂饮食引起的肠道稳态失衡，抑制炎症。

表4 EGCG对大鼠空肠绒毛的影响（n = 8）Table 4 Effect of EGCG on Jejunum villus in rats (n=8)

图2 EGCG对大鼠肠道病理损伤的影响（n = 8）Figure 2 Effect of EGCG on intestinal pathological injury in rats (n=8)

3 结论与讨论

由能量摄入和能量消耗失衡而导致的肥胖日益成为全球范围内主要的健康问题。然而，针对肥胖症的改善措施除生活方式的调整外，仅有少许药物如奥利司他等用于肥胖症的治疗[12]，但会引起腹泻、头痛和过敏等诸多不良副作用。因此，寻求和探明能防治肥胖的植物资源的天然活性成分以及相关作用机制逐渐成为科学家们研究的热点。基于此，本实验从“肠-脂肪”信号轴及肠道屏障的角度探究茶叶中EGCG对肥胖症大鼠肠道屏障损伤的保护作用以及降脂减肥的相关机制。

本实验结果发现，灌胃EGCG可以有效降低高脂引起的大鼠体重增加，并与我们先前的研究结果一致[11]；EGCG也可明显降低体脂率并减少脂肪细胞大小。EGCG降低体重与其改善葡萄糖耐量及脂质代谢紊乱有关[13]。最新的研究表明，EGCG的这一作用归因于其通过调节Beclin1自噬促进脂肪组织脂质分解发挥作用[14]。

LPS是由革兰氏阴性细菌产生的，在肠道屏障功能损伤后，其通过MYD88/TLR4通路进入体循环并引发机体免疫反应，严重时可引发内毒素血症[15]。DAO由小肠粘膜产生，在肠道屏障损伤后会大量进入血液，已成为评价肠道屏障功能的常见指标[16]。我们研究发现，EGCG可有效降低血清中LPS、DAO和TNF-α含量，并减少空肠上皮间淋巴细胞数量来抑制肠道炎症，与本实验中脂肪组织病理学切片中的炎症现象减弱一致。这可能与EGCG抑制高脂饮食宿主肠道有害细菌生长，减少LPS的产生从而抑制炎症有关[17]。先前的研究表明，EGCG可抑制肝脏TLR4表达来减轻肝脏炎症[18]，我们推测EGCG在肠道TLR4通路中可能也发挥类似的作用从而减少LPS的转运。肠道绒毛被破坏后，内毒素会更容易进入细胞激活炎症级联信号造成机体损伤，且机体能量吸收会严重失衡[19]。我们发现给药EGCG可以有效保护肥胖症大鼠的肠道绒毛完整性，增加V/C值，减少肠道炎症和水肿现象。

综上，茶叶中EGCG可降低大鼠体重，减少脂肪蓄积及炎症现象，从而有效改善大鼠肥胖症状；同时有效保护肠道屏障完整性及功能，减少LPS进入体循环，降低血清炎症因子水平。本实验结果提示了EGCG对高脂饮食诱导的肥胖大鼠肠道屏障的保护作用，调节“肠-脂肪”信号轴，这可能也是其改善肥胖大鼠脂肪聚集及相关炎症的作用机制。