肖文敏，唐小燕，任志红，吴焕焕，张 虹，尚 涛，仇 园，孙海伟*，韩晓阳,3*

1. 泰安市农业科学研究院，山东 泰安 271000；2. 山东农业大学 园艺科学与工程学院，山东 泰安 271018；

3. 作物生物学国家重点实验室，山东 泰安 271018；4. 泰安市食品药品检验检测研究院，山东 泰安 271000

茶树[Camellia sinensis (L.) O. Kuntze] 原产于中国云贵高原及其邻近的川、桂、湘等边区的深山密林中[1-3]，茶具有提神保健、消炎解毒及预防新陈代谢疾病等诸多功效，与咖啡、可可并称为世界三大植物性饮料。近年来，随着国内外消费者对茶叶品质和安全的高度关注，茶叶农药残留问题愈加凸显，解决茶叶农残问题迫在眉睫[4]。

电子鼻（e-nose），又称嗅觉模拟系统，是一种利用传感器模拟生物嗅觉原理的新型仿生检测手段。自1964年首次出现对嗅觉过程的电子模拟[5]到1982年首次提出电子鼻系统的概念[6]，经过数十年的研究发展[7]，电子鼻技术与产品愈加成熟，逐渐应用于农业、食品与环境等领域[8-15]。电子鼻技术较之气相色谱法（Gas Chromatography, GC）、高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography, HPLC）、气相色谱-质谱联用（Gas Chromatography-Mass Spectrometer，GC-MS）等传统检测技术[16-19]，操作更加快捷、简单，成本低且检测及时性高，解决了之前农残检测专业性过强和难以现场检测等问题。目前，已有电子鼻技术应用于果蔬类农残检测的报道，其中针对有机磷类农药的研究较多[20-22]，但在茶叶农残检测方面的应用仍有不少空白。

农药往往因含有烃基类醚类物质而产生一些挥发性气味，不同农药的分子结构和理化性质不同，故而其挥发性/半挥发性物质的气味类型和强烈程度等不同。因此，从待检材料挥发出的气味入手，利用电子鼻进行农药残留的定性及定量分析可靠性强。本试验基于电子鼻技术，对茶鲜叶中菊酯类杀虫剂农药和常见广谱除草剂类农药的种类以及浓度进行检测，对不同农药进行模式识别，并建立单一农药浓度预测模型，从而开启一种茶鲜叶杀虫剂类和除草剂类农药残留快速诊断新方法, 以在源头控制茶叶中的农药残留问题。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试茶鲜叶来自山东省泰安市君思饮茶叶有限公司，为未喷洒农药的茶树一芽二叶鲜样，随机取样后立即进行喷药处理及检测。

试验选用的菊酯类杀虫剂农药包括：高效 氯 氟 氰 菊 酯（Lambda-cyhalothrin，Cyh；有效成分含量2.5%）、高效氯氰菊酯（Beta cypermethrin，Cyp；有效成分含量4.5%）、甲氰菊酯（Fenpropathrin，Fen；有效成分含量20%）、联苯菊酯（Bifenthrin，Bif；有效成分含量10%）。常见广谱除草剂类农药包括：草铵膦（Glufosinate ammonium，Glu；有效成分含量20%）、草甘膦（Glyphosate，Gly；有效成分含量30%）。

1.2 试验设计

因当前无茶鲜叶相关农残标准，故试验参考《GB 2763—2019 食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》中商品茶标准[27]，茶叶中高效氯氟氰菊酯最大残留量为15 mg/kg、高效氯氰菊酯为20 mg/kg、甲氰菊酯为5 mg/kg、联苯菊酯为5 mg/kg及草甘膦为1 mg/kg、草铵膦为0.5 mg/kg。

1.2.1 定性分析

将6种农药稀释配制成国标下最大残留量浓度，以等量蒸馏水为对照（CK），进行喷施并进行电子鼻检测。

1.2.2 定量分析

每种农药设置5个浓度梯度（含国标下最大残留量浓度）进行喷施，用电子鼻对茶叶中多种浓度农药残留进行检测鉴别。具体浓度梯度设置如下：高效氯氟氰菊酯为0 mg/kg、5 mg/kg、15 mg/kg、30 mg/kg、60 mg/kg，高效氯氰菊 酯 为 0 mg/kg、10 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg、80 mg/kg，甲氰菊酯和联苯菊酯均为0 mg/kg、2 mg/kg、5 mg/kg、10 mg/kg、20 mg/kg；草铵膦为 0 mg/kg、0.2 mg/kg、0.5 mg/kg、1.0 mg/kg、4.0 mg/kg、8.0 mg/kg，草甘膦为0 mg/kg、0.5 mg/kg、1.0 mg/kg、4.0 mg/kg、8.0 mg/kg、16.0 mg/kg。

1.2.3 样品处理

为了试验进样的方便性和准确性，试验采用定量取样方法，即每次称取5 g茶叶样品于三角瓶中（参考文献[28]，综合考虑容器压强等因素，试验容器体积选用50 mL），使用注射器模拟田间施药进行农药定量（3 mL）喷施后立即用锡箔纸封口，利用PEN3型便携式仿生电子鼻系统（PEN3，AirRenRe AnalyticR GmbH，Germany）进行气体检测分析，每处理5次重复。

1.2.4 药剂实际浓度测定

使用经典气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）对配制的各农药喷药浓度进行实测，获得对应的实际浓度，每处理3次重复。

1.2.5 田间检验

通过对4种菊酯类杀虫剂进行常规田间喷药试验，5 d 后取样并分别进行GC-MS检测与电子鼻检测（另取一份样品105℃快速烘干固样备用），计算电子鼻检测准确度，每处理3次重复。

1.3 电子鼻传感器筛选优化

电子鼻检测分析采用顶空吸气法，参考文献[28]的方法对参数设置进行修改：（1）顶空吸气处理：顶空时间10 min，顶空温度 25℃；（2）每次测量前后传感器进行清洗和标准化：传感器清洗时间100 s（更换药剂种类时清洗120 s），自动调零时间10 s，样品准备时间5 s，样品测定间隔时间1 s，内部流量 600 mL/min，进样流量 600 mL/min，测量时间150 s。试验将电子鼻检测146 ～ 148 s处的信号作为传感器信号分析的时间点。采用电子鼻自带Winmuster软件进行负荷加载分析（Loadings analysis，LA）与主成分分析（Principal component analysis，PCA），对传感器进行筛选优化。

1.4 数据处理

1.4.1 定性分析

通过SPSS 22.0软件对传感器响应值进行提取优化和PCA（Principal component analysis）模式识别，根据各农药主成分分类图考察区分效果，从各个总体的样本点分布集中与否及不同总体的样本点分布重叠与否等来分析。

1.4.2 定量分析

（1）浓度含量模式识别。通过SPSS 22.0软件对优化后的传感器响应值进行PCA分析，判断每种农药不同浓度梯度区分度。（2）浓度预测模型的建立及检验。通过SPSS 22.0软件利用偏最小二乘回归算法（Partial least squares，PLS）建立菊酯类杀虫剂及广谱除草剂类各农药的浓度含量预测模型，并进行检验。通过对模型预测浓度值与实测浓度值进行线性拟合，根据相关系数与估计标准误差（Standard error estimate，Se）等指标检验预测模型的准确性。

2 结果与分析

2.1 电子鼻传感器优化结果

PEN3型通用传感器共10个，分别为W1C、W5S、W3C、W6S、W5C、W1S、W1W、W2S、W2W和W3S，不同传感器所侧重检测的气体成分不同（表1）[28]，因此电子鼻传感器对“茶叶+农药气味物质”的响应存在差异。结果显示，传感器W5S、W1S、W1W、W2S、W2W响应值变化范围分别为1.52 ～ 12.05、1.40 ～ 8.50、2.02～ 12.42、1.26 ～ 4.39和2.18 ～ 24.34，响应值较高，对相关气体物质敏感度较大；而W1C、W3C、W6S、W5C、W3S传感器响应值均小于或约等于1.0，表明其对相关气体物质的响应不敏感。

表1 PEN3型电子鼻传感器属性Table 1 Sensor attributes of the PEN3 e-nose

同时，各传感器对不同药剂的区分贡献率不同，通过负荷加载分析可判断10个传感器区分能力的大小：通常坐标值离原点（0，0）越远的传感器，响应越强，区分贡献率越大[28]。由图1a ～ 图1i可见，传感器W5S、W1S、W1W、W2S、W2W对于菊酯类杀虫剂农药、广谱除草剂类农药组内与组间区分贡献率较大；由图2a ～ 图2b可见，选择传感器W5S、W1S、W1W、W2S、W2W列阵对6种农药进行PCA分析，在保证各药剂间区分度和消除传感器冗余的同时，2个主要成分的累积方差贡献率总和与主成分1的累积方差贡献率较10个传感器列阵的均有所增加（2个主要成分的累积方差贡献率总和超过95%，主成分1的累积方差贡献率达90.74%），分析准确率相应提高。因此，本试验选择传感器W5S、W1S、W1W、W2S、W2W进行分析。

图1 10个传感器对不同种类农药的负荷加载分析(LA)Figure 1 Loadings analysis (LA) of 10 sensors for different kinds of pesticides

图2 电子鼻不同传感器列阵气味数据主成分分析（PCA）Figure 2 Principal component analysis (PCA) of odor data from different sensor arrays in electronic nose

2.2 定性分析结果

从图3可见，通过SPSS 22.0利用主成分分析法（PCA）对响应特征值降维和分类，6种农药模式识别表现较强区分度；其中，除草剂类与杀虫剂类组间区分度较好，除草剂类组内区分度较高，杀虫剂类组内高效氯氰菊酯与高效氯氟氰菊酯、甲氰菊酯间的区分度略低。从第一主成分（90.7450%）区分度分析（表2），除草剂类与杀虫剂类组间差异极显著（p < 0.01），除草剂类组内差异极显著（p < 0.01），杀虫剂类组内高效氯氟氰菊酯、高效氯氰菊酯与甲氰菊酯间差异显著性略低；从第二主成分（5.1014%）区分度分析，联苯菊酯与草铵膦、草甘膦间差异显著性略低，其他农药间差异显著或极显著。可见，利用电子鼻对茶叶（菊酯）杀虫剂类与除草剂类农药的混合区分度较好。

表2 6种农药电子鼻气味数据主成分分析（PCA）的区分度（146 ～ 148s）Table 2 Discrimination power of PCA of odor data of electronic nose on 6 pesticides at 146 ～ 148s

图3 不同农药电子鼻146 ～ 148s时间点气味数据的主成分分析Figure 3 Principal component analysis of odor data of electronic nose on different pesticides at 146 ～ 148s

2.3 定量分析结果

2.3.1 浓度含量模式识别结果

以5个最优传感器为分析传感器对杀虫剂与除草剂两类6种农药不同浓度的响应特征值进行主成分分析（图4a ～ 图4f），各农药的不同浓度数据可较为有效区分。（菊酯）杀虫剂类农药各浓度梯度第一主成分与第二主成分分析值大致在-2 ～ 2范围内，且各浓度第一主成分分析值的线性关系较为明显；其中，高效氯氟氰菊酯5个浓度线性关系最为显著，高效氯氰菊酯10 mg/kg、20 mg/kg与40 mg/kg 3个浓度、甲氰菊酯2 mg/kg与5 mg/kg 2个浓度有一定重合，推测建立浓度模型预测时可能存在一定误差。除草剂类农药各浓度梯度第一主成分与第二主成分分析值大致在-1 ～ 3、-2 ～ 2范围内，各浓度第一主成分分析值亦存在线性关系，但0 mg/kg（清水处理）的第一主成分分析值要明显大于其他浓度值；其中，草甘膦除0 mg/kg以外的其他4个浓度第二主成分分析值线性关系也较为显著。

图4 单一农药不同浓度电子鼻气味数据的主成分分析Figure 4 Principal component analysis of odor data of electronic nose on different concentrations of single pesticide

2.3.2 浓度预测模型的建立

选取响应值较大的W5S、W1S、W1W、W2S和W2W传感器响应值，采用偏最小二乘法（PLS）对同种农药不同浓度梯度建立预测模型：

模型Ⅰ(Cyh): Y= -23.609+3.097R2-3.691R6+0.985R7+3.054R8+1.800R9

模型Ⅱ(Cyp): Y= 3.598+1.802R2+22.011R6-1.519R7-28.943R8+0.012R9

模型Ⅲ(Fen): Y= -4.594+8.775R2-4.106R6-3.982R7+3.461R8+0.689R9

模型IV(Bif): Y= -15.622+1.408R2-3.316R6-2.518R7+9.061R8+1.207R9

模型V(Glu): Y= 2.992-1.539R2+4.491R6+3.070R7-10.009R8+0.054R9

模型VI(Gly): Y= 7.480-6.060R2+10.287R6-0.925R7--6.278R8-1.326R9

公式中，Ri为 第i个传感器在146 ～ 148 s时间点的信号响应值（第i个传感器接触到样品挥发物后的电阻量G(Ω)与传感器在经过标准活性碳过滤气体的电阻量G0 (Ω)的比值），R2=G/G0W5S、R6= G/G0W1S、R7= G/G0W1W、R8= G/G0W2S、R9= G/G0W2W。将传感器响应值带入上式，得出的 Y值即为杀虫剂/除草剂农药的预测浓度。从表3方差分析可见，模型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、IV、V、VI 的P值均小于0.001，表明PLS回归模型具有极显著性。

表3 杀虫剂类和除草剂类农药浓度预测模型的方差分析Table 3 Variance analysis of concentration prediction model of insecticides & herbicides

2.3.3 浓度预测模型检验结果

通过所建模型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、IV、V、VI进行浓度含量预测，对各农药的浓度预测值与GC-MS实测值进行线性拟合，检验模型准确性。从图5a ～ 图5f可见，各农药浓度预测值与实测值拟合程度较好，高效氯氟氰菊酯、高效氯氰菊酯、甲氰菊酯、联苯菊酯、草铵膦和草甘膦浓度预测值与实测值之间的相关系数为0.985、0.967、0.947、0.965、0.982和0.968，估计标准误差为2.696、5.269、1.718、1.371、0.200和0.544；6种农药的浓度预测值与实测值间相关系数高，估计标准误差较小，模型代表性较高，该模型能够较为准确地对茶树叶片中高效氯氟氰菊酯、高效氯氰菊酯、甲氰菊酯、联苯菊酯、草铵膦和草甘膦等农药的浓度含量进行预测。但是，高效氯氰菊酯10 mg/kg、20 mg/kg与40 mg/kg 3个浓度及甲氰菊酯2 mg/kg与5 mg/kg 2个浓度有部分预测值区分度较小，这与浓度含量模式识别误差预测一致（图4b ～ 图4c），考虑与药剂挥发性及电子鼻特性等有关；同时，草铵膦与草甘膦的浓度预测在0 ～ 0.2（0.5）mg/kg范围内精度较低，考虑所建浓度预测模型在较低浓度范围内的适用性有待进一步优化。另外，不同农药因挥发性/半挥发性物质存在差异，检测精度的影响因子有待进一步探究。

图5 茶叶杀虫剂类和除草剂农药含量预测模型对预测浓度与实际浓度的拟合图Figure 5 Fitting diagram of the prediction model of tea insecticide and herbicide content to prediction concentration and actual concentration.

2.4 田间检验结果

通过菊酯类杀虫剂田间喷药试验，综合GC-MS检测与电子鼻检测，计算高效氯氟氰菊酯、高效氯氰菊酯、甲氰菊酯和联苯菊酯4种药剂茶样农残量电子鼻检测准确度分别为：91.011%、86.159%、85.206%和86.384%，且两种方式检测数据的线性拟合程度较好（表4）。可见，电子鼻田间检验准确度较高，可从鲜叶源头检测把控，具备实际生产操作性。

表4 GC-MS检测和电子鼻检测的茶样农残含量与其线性拟合参数Table 4 Determination of pesticide residues in tea samples by GC-MS and e-nose & their linear fitting parameters

3 讨论

本试验对电子鼻传感器进行有效筛选优化，确定了茶树菊酯类杀虫剂与广谱除草剂类农药种类定性分析与浓度定量分析的最优传感器列阵，并对茶树两大类6种常见农药进行有效的PCA模式识别。研究建立了6种农药单一药剂的浓度预测模型，预测模型检验准确度较高，并通过田间试验证明具有实际生产操作性。

试验过程中发现，电子鼻检测环境并非单一环境，存在一定影响因素。一方面，茶树鲜叶中的挥发性物质种类多以及随离体时间推移转化快[29-31]等因素干扰着传感器响应；如郑鹏程等研究发现在茶鲜叶摊放一定时间（6 ～ 12 h）中，其香精油总量与香气组分数量均处于较高的水平[29]，茶叶香气等非目标检测物的干扰影响电子鼻对药剂的识别；另一方面，现有电子鼻容易受到环境温度、湿度和气压等因素的干扰，且环境变化对传感器响应的干扰通过简单的滤波等方法无法抑制；梁志芳等研究提出了基于模式错配的干扰消除方法（PMIE）和基于域校正-自适应极限学习机模型（DC-AELM）等干扰抑制方法，但仍需在复杂环境中不断验证与完善[32]。

本试验研究发现，农残限量为15 mg/kg的高效氯氟氰菊酯的浓度预测值较为准确，但农残限量值较低的草铵膦（0.5 mg/kg）在0 ～ 0.2 mg/kg浓度范围的含量预测精度较低，这是浓度梯度小于电子鼻预测误差（绝对值）的体现，反映了电子鼻精度与检测要求间的差距，电子鼻在低浓度下的精准检测能力仍需进一步优化；王昌龙等采用“特征比值法”对响应曲线进行特征提取，有效消除了浓度的影响，由此可见特征提取方法等方面仍有较大研究空间[33]。此外，含磷除草剂类农药的挥发性与稳定性易受环境影响[34]，也可能是误差产生的原因之一。可见，如何提高不同药剂的电子鼻检测精度值需进一步研究。

从茶鲜叶入手，可以监督茶园尤其是有机茶园的用药情况, 有效引导茶农合理施药, 从而实现茶叶农药源头控制，把茶叶安全生产危害分析的关键控制点（HACCP）前移，同时减少农药不合理施用带来的茶园土壤环境污染[35]。有研究发现，在茶叶加工过程中存在着不同程度的农药消解现象，消解率大致在20% ～ 80%，农药的消解程度与其理化性质（蒸气压、水溶性、光热稳定性等）密切相关[36-37]。研究表明红茶加工对农药的消解作用显著高于绿茶加工，不同加工工艺的消解贡献率大小依次为：干燥＞萎凋、摊放＞杀青、揉捻、发酵[37-38]。姜咸彪等研究报道了不同农药种类和茶叶品种间的消解率存在较大差异[39]。此外，研究发现不同施药量或鲜叶农残量条件下的加工消解作用也不相同[40-41]。因此，在把控茶鲜叶原料的同时，如何优化茶园防控管理，辅以科学的加工工艺提高农药消解率，对茶叶生产安全性也有着现实意义。

本试验研究证明了基于电子鼻技术的茶叶不同农药残留检测的可操作性，并建立了各农药的浓度预测模型，达到了预期效果。同时，针对研究中发现的问题，下一步我们将从电子鼻传感器优化、检测环境及非目标检测物干扰消除、农药种类及浓度拓展等方面进行探究，以期提高电子鼻检测精度，使基于电子鼻技术的茶叶农残快速诊断更加精准。