水分散-DNPH衍生-LC-MS/MS法同时测定电子烟液中8种羰基物

2021-08-26潘立宁刘绍锋李东亮樊美娟王晓瑜施丰成孙学辉刘瑞红秦亚琼

烟草科技 2021年8期

潘立宁，刘绍锋*，李东亮，樊美娟，沈怡，王晓瑜，施丰成，罗诚*，孙学辉，刘瑞红，秦亚琼

1.中国烟草总公司郑州烟草研究院，郑州高新技术产业开发区枫杨街2号 450001

2.四川中烟工业有限责任公司技术中心卷烟减害降焦四川省重点实验室，成都市锦江区成龙大道一段56号610021

近年来，随着全球控烟力度不断加大，一些发达国家传统卷烟的销量出现了一定的下降趋势，而电子烟在全球销量呈快速增长之势［1-3］。作为电子烟的重要组成部分，电子烟液的质量安全直接影响消费者的健康。低分子羰基物是一类对人体感觉系统和呼吸系统有强烈刺激作用的有害物质，特别是甲醛、乙醛、丙酮、丙烯醛、丙醛、巴豆醛、2-丁酮和丁醛8种低分子羰基物［4］。这8种羰基物均被列于Hoffmann名单中［5］，甲醛、乙醛和巴豆醛分别被国际癌症研究机构（International Agency for Research on Cancer，IARC）列为1类、2B类、3类人类致癌物［6］，丙烯醛被美国环境保护署（US Environmental Protection Agency，US EPA）列入“有害大气污染物名单”［7］。为保障电子烟液的安全性，规范电子烟市场，部分国家和地区对电子烟液中的羰基物进行了规范或限量［8-9］。准确测定电子烟液中羰基物的质量分数对于确定羰基物的形成机理和评价其对人体健康的影响具有重要意义。低分子量羰基物由于极性大、反应活性高、易挥发等特点，通常对其衍生化后再采用色谱或光谱技术进行检测［10］。羰基物与DNPH的衍生应用广泛［11-25］，由于腙类化合物在高温下会发生分解，液相色谱（LC）比气相色谱（GC）更适合对羰基物的腙类产物进行测定［13］，DNPH衍生-LC检测法被一些国家的标准化机构用作分析主流烟气中羰基物的标准方法［14-15］。目前，电子烟气溶胶中羰基物的研究较多，而电子烟液中羰基物分析方法的相关报道较少。Lim等［23］利用2,2,2-三氟乙基肼对羰基物进行衍生，采用顶空固相微萃取-GC-MS联用法测定电子烟液中的甲醛、乙醛和丙烯醛；Varlet等［24］使用盛有DNPH的吸附管捕集电子烟液中的羰基物，经乙腈洗脱后采用LC-UV/MS法进行测定。

在本研究中，采用DNPH衍生化羰基物、采用LC-MS/MS法进行检测，解决了在样品前处理过程中因甘油和DNPH乙腈溶液不混溶导致的溶液分层问题以及腙类产物在酸性条件下的降解问题，旨在为电子烟液中多种羰基物的同时测定提供方法参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

收集市场上22种不同品牌、不同口味和不同烟碱量的电子烟液样品。

甲醛-2,4-二硝基苯腙（＞97%）、乙醛-2,4-二硝基苯腙（＞98%）、丙酮-2,4-二硝基苯腙（＞98%）、丙烯醛-2,4-二硝基苯腙（＞95%）、丙醛-2,4-二硝基苯腙（＞97%）、巴豆醛-2,4-二硝基苯腙（＞98%）、2-丁酮-2,4-二硝基苯腙（＞98%）、丁醛-2,4-二硝基苯腙（＞96%）（标准品，日本东京化成工业株式会社）；甲醛-2,4-二硝基苯腙-d3、乙醛-2,4-二硝基苯腙-d（3标准品，＞98%，上海安谱公司）。

水（自制，符合GB/T 6682—2008规定的一级水，电阻率18.2 MΩ·cm）；甲醇、乙腈（色谱纯，美国Dikma公司）；吡啶（色谱纯）、2,4-二硝基苯肼（DNPH，＞98%）（美国Sigma-Aldrich公司）；高氯酸［70%（质量分数），比利时Acros Organics公司］。

1.2 方法

1.2.1 标准工作溶液的配制

采用乙腈配制8种羰基物-2,4-二硝基苯腙的混合标准储备液，以及甲醛-2,4-二硝基苯腙-d3和乙醛-2,4-二硝基苯腙-d3的混合内标储备液，置于-20℃冰箱中保存。采用乙腈稀释配制甲醛-2,4-二硝基苯腙-d3和乙醛-2,4-二硝基苯腙-d3的浓度均为20μg/mL的内标工作液。采用乙腈逐级稀释并加入内标工作液配制系列标准工作溶液，系列标准工作溶液中各羰基物-2,4-二硝基苯腙的浓度分别为10、20、50、100、200、500、1 000 ng/mL，内标浓度为200 ng/mL。

1.2.2 样品前处理和仪器条件

称取0.2 g电子烟液样品于10 mL容量瓶中，依次加入1.2 mL去离子水、2 mL 1.2 mg/mL DNPH乙腈溶液以及80μL高氯酸水溶液，摇匀，室温放置60 min进行衍生化反应。反应结束后加入200μL吡啶和100μL内标工作溶液（甲醛-2,4-二硝基苯腙-d3和乙醛-2,4-二硝基苯腙-d3的混合溶液，浓度均为20μg/mL），并用乙腈定容至10 mL，摇匀。溶液过有机相滤膜，将滤液进行LC-MS/MS分析。分析条件：

色谱柱：Acclaim®Explosive E2柱（3 mm×150 mm，3μm，120Å）；柱温：30℃；进样量：5μL；流动相A：水；流动相B：乙腈；洗脱方式：40%A+60%B等度洗脱；流速：0.4 mL/min；离子源：电喷雾电离源（ESI）；扫描方式：负离子扫描；检测方式：多反应监测模式（MRM）；电喷雾电压：-4 200 V；离子源温度：500℃；气帘气压力：0.138 MPa；碰撞气压力：0.041 MPa；辅助气1压力：0.276 MPa；辅助气2压力：0.276 MPa；监测离子对信息见表1。

表1 各衍生物的内标物、母离子、子离子、去簇电压、碰撞能量及保留时间Tab.1 Internal standards，precursor ions，product ions，declustering potentials，collision energies and retention time of the derivatives

2 结果与讨论

2.1 LC-MS/MS法与HPLC法比较

文献研究表明，电子烟液中低分子量羰基物质量分数水平为μg/g级；为了改善口感，电子烟液中加入不同种类的香味成分，导致电子烟液基质比较复杂，不同电子烟液样品基质差异较大［23-24］。选择2个市售电子烟液样品，按照1.2.2节的方法进行样品前处理，然后分别采用LC-MS/MS法和LC法进行测定，LC条件参见文献［7］。

图1为标准溶液和2个电子烟液样品中8种羰基物-2,4-二硝基苯腙的LC-MS/MS提取离子色谱图（图1a）和LC谱图（图1b）。LC-MS/MS提取离子色谱图显示，样品1中含有甲醛和乙醛，样品2中含有甲醛、乙醛和2-丁酮。LC谱图显示，在样品1中也检测甲醛、乙醛，但因杂质干扰，甲醛的色谱峰前沿处有凸起，难以准确定量，且丙烯醛及丙醛色谱峰中间存在很大的杂质峰；样品2中检出甲醛和乙醛，但未检出2-丁酮，且在巴豆醛出峰位置出现了很大的色谱峰，该峰经LC-MS/MS法证实为杂质峰而非巴豆醛，并将2-丁酮色谱峰掩盖。由此可见，由于电子烟液基质比较复杂，且不同电子烟液样品基质差异较大，采用LC法难以准确检测样品中的8种羰基物；LC-MS/MS法灵敏度高，且选择性好，适于电子烟液中8种羰基物的测定。

图1 标准溶液和2个电子烟液样品中8种羰基物-2,4-二硝基苯腙的LC-MS/MS提取离子色谱图（a）和LC图（b）Fig.1 Extracted ion chromatograms（a）and liquid chromatograms（b）for eight carbonyls in standard solution and two e-liquid samples

2.2 DNPH溶液溶剂的优化

甲醇和乙腈为LC-MS/MS法的常用流动相，DNPH在甲醇和乙腈中的溶解性良好，因此分别采用甲醇和乙腈配制一定浓度的DNPH溶液，考察两种溶剂产生的背景对检测结果的影响。具体步骤：移取2 mL DNPH甲醇溶液（或DNPH乙腈溶液）和80μL高氯酸水溶液于10 mL容量瓶中，摇匀，室温放置60 min进行衍生化反应。然后，加入200μL吡啶，采用甲醇（或乙腈）定容至10 mL，摇匀。将溶液过有机相滤膜，进行LC-MS/MS分析。分析条件同1.2.2节。

3.2 主要临床表现钩虫性十二指肠炎综合征是由钩虫寄生于小肠所引起的疾病，钩虫性十二指肠炎综合征患者因感染钩虫的数量、时间及个人的身体状况常呈现轻重不一的临床表现。本征多先有胃纳增加而体重减轻，上腹部不适，可有不同程度的隐痛，餐后腹胀。后期食欲不振，可有恶心、呕吐、便秘或腹泻，甚至黑便、柏油样便、血便等消化道出血表现。贫血严重时胃酸分泌减低，可有异嗜癖、嗜酸性粒细胞增多症，甚至发生嗜酸性脓肿导致肠梗阻表现。钩虫感染轻者可无症状，部分可有贫血、营养不良、胃肠功能失调，重者可有发育障碍及心功能不全[7]。

结果表明，采用甲醇配制DNPH溶液会造成很大背景（图2a），DNPH甲醇溶液背景中存在6种羰基物的2,4-二硝基苯腙产物，这6种羰基物分别为甲醛、乙醛、丙酮、丙醛、2-丁酮、丁醛。其中，甲醛-2,4-二硝基苯腙的色谱峰很高，丙酮-2,4-二硝基苯腙和2-丁酮-2,4-二硝基苯腙的色谱峰较高，乙醛-2,4-二硝基苯腙、丙醛-2,4-二硝基苯腙和丁醛-2,4-二硝基苯腙的色谱峰相对较低，这些背景峰影响测定结果的准确性。使用购自不同公司的甲醇试剂配制DNPH溶液，结果无显著性差异。低分子量羰基物可能由甲醇试剂引入，尽管实验中所用为HPLC级试剂，但仍含有微量的羰基物，其与DNPH反应会带来较高的背景值。在DNPH乙腈溶液背景中检出了甲醛-2,4-二硝基苯腙和乙醛-2,4-二硝基苯腙。已知空气中存在甲醛和乙醛，在背景中检测出甲醛和乙醛是不可避免的。相对于DNPH甲醇溶液，DNPH乙腈溶液的本底小得多，因此选择用乙腈配制DNPH溶液，同时所有结果均需要扣除溶剂背景。

图2 DNPH甲醇溶液（a）和DNPH乙腈溶液（b）背景中8种羰基物腙类产物的提取离子色谱图Fig.2 Extracted ion chromatograms for eight carbonyls in treated DNPH/methanol solution（a）and DNPH/acetonitrile solution（b）

2.3 分散剂用量的选择

电子烟液主要由丙二醇和甘油组成，其在不同电子烟液中的比例差异很大。甘油与乙腈不混溶，导致甘油质量分数较高的电子烟液样品与DNPH乙腈溶液混合时出现分层现象，影响测定结果。为了使反应体系均一化，在电子烟液样品中引入一定量水进行分散后，再加入DNPH乙腈溶液。DNPH在乙腈中溶解度较大，在水中溶解度较小，当加入大量水后，DNPH会析出。因此，为了避免分层和DNPH析出，考察了水和DNPH乙腈溶液的加入量。

采用同等质量的甘油代替电子烟液样品进行避免分层实验：当水的加入量大于甘油质量的6倍以上，无论加入多少DNPH乙腈溶液，反应体系均不会出现分层现象。避免DNPH析出实验表明，保证DNPH不析出的允许加水量与DNPH浓度有关：当DNPH浓度为2 mg/mL时，若加水量不大于乙腈使用量，DNPH不会析出；当DNPH浓度减小，允许加水量将增加。根据以上分析，对于0.2 g电子烟液样品，加入1.2 mL水（加入水的质量为样品质量的6倍），再加入2 mL 1.2 mg/mL的DNPH乙腈溶液（加水量小于乙腈使用量）进行衍生化反应时，既不会出现分层现象，也不会析出DNPH。

2.4 衍生过程参数优化结果

电子烟液中的羰基物能否与DNPH完全反应生成相应的腙类衍生物显著影响结果的准确性。以分析物与内标的面积比作为评价指标，分别研究确定DNPH浓度、高氯酸浓度和反应时间参数（图3）。实验所用的电子烟液样品可检出甲醛、乙醛、丙酮和丙醛，为了考察衍生过程参数对电子烟液中8种羰基物衍生化反应结果的影响，在该电子烟液样品中加入一定量丙烯醛、巴豆醛、2-丁酮和丁醛。

2.4.1 DNPH浓度

腙类衍生物的生成量取决于DNPH与分析物的摩尔比［25］，因此采用不同浓度的DNPH溶液处理电子烟液样品。如图3a所示，随DNPH浓度增加，8种羰基物的2,4-二硝基苯腙衍生物先逐渐增加，然后保持不变。DNPH浓度由0.2 mg/mL增加至1.4 mg/mL，各腙类衍生物的响应依次增加至原来的2.45倍（甲醛-2,4-二硝基苯腙）、1.20倍（乙醛-2,4-二硝基苯腙）、3.82倍（丙酮-2,4-二硝基苯腙）、1.46倍（丙烯醛-2,4-二硝基苯腙）、1.54倍（丙醛-2,4-二硝基苯腙）、1.30倍（巴豆醛-2,4-二硝基苯腙）、2.26倍（2-丁酮-2,4-二硝基苯腙）和1.18倍（丁醛-2,4-二硝基苯腙）。当DNPH浓度为1.2 mg/mL时，8种羰基物的2,4-二硝基苯腙的响应最高；继续增加DNPH浓度，响应不再增加。因此，选用DNPH浓度为1.2 mg/mL。

图3 衍生过程参数对测定结果的影响Fig.3 Effects of derivation parameters on determination results

2.4.2 高氯酸浓度

羰基物与DNPH发生反应，需要在酸性条件下进行，反应体系酸性强弱直接影响反应效率。因此，考察了不同浓度高氯酸水溶液对衍生化反应结果的影响（图3b）。结果表明，当高氯酸浓度由1.4%增加至10.5%时，除丙烯醛外，其他7种羰基物的2,4-二硝基苯腙响应先逐渐增加，然后保持不变。当高氯酸浓度由1.4%增加至5.6%时，丙烯醛-2,4-二硝基苯腙响应逐渐增加；高氯酸浓度为5.6%～7.0%范围内，丙烯醛-2,4-二硝基苯腙的响应保持不变；高氯酸浓度继续增加，丙烯醛-2,4-二硝基苯腙响应下降。这主要是由于丙烯醛-2,4-二硝基苯腙在酸性较高条件下容易发生聚合反应［11-12］。当高氯酸浓度由1.4%增加至10.5%时，8种羰基物的2,4-二硝基苯腙的响应最大值与最小值的比例分别为甲醛-2,4-二硝基苯腙1.71、乙醛-2,4-二硝基苯腙1.49、丙酮-2,4-二硝基苯腙3.10、丙烯醛-2,4-二硝基苯腙7.05、丙醛-2,4-二硝基苯腙2.25、巴豆醛-2,4-二硝基苯腙21.67、2-丁酮-2,4-二硝基苯腙8.59和丁醛-2,4-二硝基苯腙2.16。由此可见，在羰基物与DNPH反应体系中，高氯酸浓度大小为非常重要的一个参数，尤其对丙烯醛、巴豆醛和2-丁酮衍生化反应影响很大。当高氯酸浓度为7.0%时，8种羰基物的2,4-二硝基苯腙的响应均达到最大。因此，选择高氯酸浓度为7.0%。

2.4.3 反应时间

反应时间是衍生过程的重要参数，当电子烟液中的羰基物与DNPH反应一段时间后，加入一定量吡啶终止衍生反应，以评价反应时间对测定结果的影响。图3c表明，当反应时间为30 min时，除甲醛外，其余7种羰基物与DNPH反应完全，继续增加反应时间至100 min，该7种羰基物的腙类衍生物无明显变化。甲醛与DNPH反应较慢，当反应时间为60 min时，甲醛-2,4-二硝基苯腙的响应达到最大。因此，选择反应时间为60 min。

2.5 加入吡啶的确定

文献研究表明，丙烯醛和巴豆醛的DNPH腙类衍生物在酸性条件下易发生聚合反应［11-12］。因此在电子烟液中的羰基物与DNPH反应完全后，加入一定量吡啶中和溶液中过量的酸。考察了吡啶对电子烟液中丙烯醛和巴豆醛测定结果的影响，对样品溶液每小时取样测定1次，持续测定10 h。结果显示，加入适量吡啶后，丙烯醛和巴豆醛的相对标准偏差均小于6%；而不添加吡啶时，两种分析物的响应逐渐降低，相对标准偏差均大于20%。

2.6 方法表征

分别对系列标准工作溶液进行LC-MS/MS分析，以羰基物腙类衍生物与内标的峰面积比对相应羰基物的浓度进行线性回归，得到各羰基物的标准工作曲线（表2）。可知，标准曲线线性关系良好，相关系数均大于0.999。以3倍信噪比（S/N=3）计算检测限（LOD），10倍信噪比（S/N=10）计算定量限（LOQ），8种羰基物的检测限在5～28 ng/g之间，定量限在17～93 ng/g之间。

表2 8种羰基物的线性方程、相关系数、检测限和定量限Tab.2 Linear equations，correlation coefficients，LODs and LOQs of eight carbonyls

在电子烟液样品中分别加入低、中、高3个浓度水平进行加标回收率实验。由表3可知，8种羰基物的平均加标回收率在92.5%～106.4%之间。对加标样品进行5次日内和日间平行测定，8种羰基物日内和日间的相对标准偏差分别在3.2%～6.2%和4.1%～7.9%之间。

表3 8种羰基物的回收率、日内和日间精密度Tab.3 Recoveries,intra-and inter-day precisions of eight carbonyls

2.7 实际样品分析

采用该方法测定了22种电子烟液样品中8种羰基物的质量分数，如表4所示。结果发现：①所测电子烟液样品中均含有甲醛和乙醛，甲醛质量分数在0.19～13.84μg/g之间，乙醛质量分数在0.63～9.60μg/g之间。②有15种样品中检出丙酮，检出率为68.2%，其中14种样品中的质量分数均小于1μg/g；仅1种样品中质量分数较高，为7.15μg/g。③丙烯醛、丙醛、巴豆醛、2-丁酮和丁醛的检出率分别为31.8%、45.4%、9.1%、31.8%、13.6%，且这5种羰基物的质量分数均小于1μg/g。