陈志远， 刘艳妮， 高 琪， 郭 媛

(1.陕西理工大学 生物科学与工程学院， 陕西 汉中 723000；2.陕西省资源生物重点实验室， 陕西 汉中 723000；3.西北农林科技大学 农学院， 陕西 杨凌 712100)

蓝莓属于杜鹃花科(Ericaceae)越橘属(Vaccinium)小浆果类果树[1-2]，具有较高的营养价值和药用价值，颇受人们的欢迎[3]。近年随着蓝莓种植面积逐年扩大，其病害也日趋严重，由真菌引起的蓝莓病害多达几十种，其中根腐病是真菌病害之一[4]，严重影响蓝莓生长，危害蓝莓产业发展。镰刀菌(Fusarium)作为一种世界性分布的土传病原真菌[5]，是引起蓝莓根腐病的主要病原菌，其寄主广泛，适应性强，可侵染多种植物引起根腐病，如橡胶树、紫花苜蓿及猕猴桃等[5]。镰刀菌侵入蓝莓根系后，释放真菌毒素进而引发蓝莓根系组织细胞坏死、腐烂，根系如有伤口会加速其侵染过程[7]。症状首先在须根上出现，毛细根先发生坏死斑，随后逐渐向上蔓延，病株根部腐烂变成褐色，茎部出现红棕色病斑，直到整个植株枯萎，叶片掉光，最后死亡[8]。开发和研究防治蓝莓镰刀菌根腐病的生防制剂对蓝莓产业发展具有重要意义。

目前镰刀菌根腐病的防治措施主要以化学防治为主，然而，长期使用化学药剂不仅会破坏土壤环境[9]，还将导致蓝莓的经济价值下降。利用微生物防治镰刀菌根腐病具有绿色、环保、可持续发展等优点[10]，正受到政府机关、广大果农和学者的关注。根据生态位理论[11]，资源丰富的环境会导致生态位宽度缩小和生态位专业化。与土壤和根际相比，根表是根系释放丰富资源的地方。实验室前期的研究结果支持根表微生物繁殖层是病原菌入侵的屏障。事实上，已经发现根际环境中的宿主相关细菌群落与病原菌表现出明显的生态位重叠，这降低了病原菌入侵成功率，并限制了入侵群落中病原菌的生长[12]。并且发现真菌物种之间，以及真菌和细菌物种之间的根表空间竞争[13]。利用生态位理论可以解释病原菌入侵根表是微生物生态位的破坏和重建过程。EDWARDS等根据微生物与根系的距离，将与植物相互作用的微生物分为土块、根际、根表、根内4个区域，其中根表微生物是植物免疫系统的重要组成部分，也是植物抵抗土传病原菌侵染的第一道防线[12,14]。但是根表微生物与病原菌在根表的相互作用机理依然所知甚少。

基于此，本文研究以在三叶草根表分离的阿氏芽孢杆菌R-B-01和一种真菌R-F-01为材料，采用形态学和分子生物学对真菌R-F-01进行鉴定，将阿氏芽孢杆菌R-B-01、真菌R-F-01与禾谷镰刀菌R-F-02三种微生物接入蓝莓组培苗根表，探究三种微生物在根表的相互作用，为阐明该微生物在蓝莓根表与镰刀菌的相互作用及机制提供理论依据，为防治蓝莓根腐病的生防菌剂的开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

蓝莓组培苗品种为夏普蓝(Sharpblue)，由陕西理工大学生物科学与工程学院实验室提供。

供试病原菌：由实验室盆栽苗中发现的蓝莓根腐病病株，采集腐烂根系，经实验室分离、鉴定和保存的禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)[15]，内部编号R-F-02。

供试细菌：采集三叶草根段，经实验室分离、鉴定和保存的阿氏芽孢杆菌(Bacillusaryabhattai)[13]，内部编号R-B-01。

三叶草根的采集：2020年6月，在陕西理工大学校园内采集三叶草根段，放入密封袋做好标记，无菌水清洗，放入4 ℃冰箱备用。

PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15 g，蒸馏水1 L。

1.2 实验仪器

体式显微镜Mro5c，德国Leica；电子显微镜pure，复纳科学仪器(上海)有限公司；高压灭菌锅YXQ-Ls-75G，上海申安医疗仪器器械厂；电子天平TD50002，余姚市金诺天平仪器有限公司；超净工作台SW-CJ-1F和霉菌培养恒温箱MJX-150BE，上海力辰邦西仪器科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌种的分离纯化

根表真菌的分离纯化[16]：从采集的三叶草根段上，切取2 cm置于PDA平板上并封口，25 ℃恒温培养箱培养7 d。待平板上长出真菌后，挑取单菌落，接种到新的PDA培养基上，重复5～6次，得到纯化的菌株命名为R-F-01。

1.3.2 菌种的鉴定

1.3.2.1 形态学鉴定

将真菌R-F-01在PDA培养基上，25 ℃培养5 d，出现菌落，观察菌落形态特征，测量菌落直径。利用显微镜观察菌丝体及其孢子、孢子梗形态、大小和颜色等特征[17]。

1.3.2.2 分子生物学鉴定

采用真菌鉴定通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)[18]。PCR反应体系(30 μL)：DNA模板1 μL，上、下游引物(10 p)各1 μL，Super Mix 15 μL，双蒸水12 μL。PCR反应条件：96 ℃ 5 min；96 ℃ 20 s，56 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 10 min，PCR产物经体积分数1.0%琼脂糖凝胶电泳，胶回收后由深圳华大基因股份有限公司完成测序，将获得的真菌R-F-01测序结果提交至NCBI数据库，利用BLAST与GenBank上已知ITS序列进行相似性比较分析[16]，在MEGA 7.0软件上进行系统发育分析，绘制真菌R-F-01的系统发育树。

1.3.3 悬浮液的制备

1.3.3.1 细菌悬浮液的制备

无菌环境下，用接种环轻轻挑取细菌的单菌落，再用无菌水稀释，制成1×109CFU /mL浓度的悬浮液，现配现用。

1.3.3.2 真菌悬浮液的制备

无菌环境下，将真菌R-F-01于PDA培养基的平板上，25 ℃恒温培养箱培养7 d，用无菌接种环刮取适量孢子，再用无菌水稀释，制成1×109CFU /mL浓度的孢子悬浮液，现配现用。

1.3.3.3 混合菌悬浮液的制备

无菌环境下，将以上制备好的阿氏芽孢杆菌R-B-01、真菌R-F-01及禾谷镰刀菌R-F-02菌液体积比1∶1∶1混合，倒入无菌离心管中，混匀，制成混合菌液，现配现用。

1.3.4 微生物侵染蓝莓根系

使用蓝莓组培生根30 d的幼苗，接入1 mL处理液，6个处理分别为：

(1)无菌水作为对照组(根系无伤口)；

(2)接入阿氏芽孢杆菌R-B-01悬液(根系无伤口)；

(3)接入棘孢木霉R-F-01悬液(根系无伤口)；

(4)接入禾谷镰刀菌R-F-02悬液(根系无伤口)；

(5)接入禾谷镰刀菌R-F-02悬液(根系有伤口)；

(6)接入混合菌悬液(根系无伤口)。

每个处理重复3次，完成后于25 ℃恒温室培养，20 d后观察蓝莓根系的变化。

1.3.5 蓝莓根系及微生物的形态学观察

1.3.5.1 体式显微镜观察

蓝莓根系样品接种培养20 d后，分别取6种不同处理的蓝莓根系，于超净工作台上分别用镊子取出蓝莓根系各3根，放置于干净培养皿中，于体视显微镜下观察其根系和微生物定殖情况。

1.3.5.2 电子显微镜观察

蓝莓根系样品接种培养20 d后，于超净工作台上用镊子分别取6种不同处理的蓝莓根系各3根，放置于干净培养皿中[19]。将直径为12 mm双面碳导电胶片粘贴在钉型样品台上，而后将样品均匀得覆盖在胶片表面，用镊子将钉型样品台夹起放于电镜标准样品杯中，旋转样品杯，动力除尘器吹几次除去灰尘后放置于电镜载物台，调节最佳视野和放大倍数对样品进行显微结构观察。

1.3.6 生防菌株抑制率的测定

采用平板对峙法测定阿氏芽孢杆菌R-B-01与真菌R-F-01对禾谷镰刀菌R-F-02的抑菌活性，对照组为只在平板中心接种禾谷镰刀菌R-F-02。每组重复4次。25 ℃培养5 d。测量相对拮抗菌方向禾谷镰刀菌R-F-02生长的直径和抑菌带宽度，计算抑制率：

2 结果与分析

2.1 三叶草根表真菌R-F-01的鉴定

2.1.1 形态学观察

从三叶草根表分离一种真菌R-F-01，在PDA培养基上25 ℃条件下培养，菌落开始时为白色，致密，圆形，随后从中央产生绿色孢子向四周扩展，菌丝生长速度较快，从浅绿、黄绿色至最后全部菌落变为绿色(图1(a))。菌落周围有白色菌丝的生长带，纤细，宽度为1.5～2.4 μm。产生分生孢子，分生孢子梗垂直对称分枝且数量较多；分生孢子单生或簇生，圆形、球形至卵形，呈绿色，大小为(2.5～4.5) μm×(2～4.0) μm(图1(b))。综合以上特征，初步分析真菌R-F-01为木霉菌(Trichoderma)。

(a)PDA培养基菌落正面 (b)分生孢子和分生孢子梗图1 真菌R-F-01菌落的形态学观察

2.1.2 分子生物学鉴定

将待测真菌R-F-01进行PCR扩增产物测序，测序结果在NCBI上进行BLAST比对并提交至GenBank进行序列一致性比较。结果显示，供试真菌R-F-01的ITS序列(GenBank登录号：MW391565)与Trichodermaasperellum有较高的同源性，相似度高达100%。对真菌R-F-01的ITS序列使用MEGA7.0构建系统发育树，表明其与Trichodermaasperellum进化距离最近(图2)。因此，根据真菌的菌落生长形态和分生孢子特征，结合ITS序列进化分析结果，鉴定该菌为棘孢木霉(Trichodermaasperellum)。

图2 真菌R-F-01的系统发育树分析

2.2 3种微生物在蓝莓根周围的相互作用

为探究阿氏芽孢杆菌R-B-01、棘孢木霉R-F-01与禾谷镰刀菌R-F-02在蓝莓根周围的相互作用，分别以单独或混合方式将3种微生物接入组培苗根系表面，培养20 d后观察。结果发现，对照组(图3A)根系健康、颜色透明、植株生长旺盛；与对照组相比，单独接入阿氏芽孢杆菌R-B-01、棘孢木霉R-F-01及禾谷镰刀菌R-F-02(无伤口)后，根系表面有菌落附着及根系颜色加深，植株叶片泛黄(图3B—D)，而在有伤口的根系中接入禾谷镰刀菌R-F-02后，根系变黑、干枯腐烂，植株部分被菌丝包裹并枯萎(图3E)。将3种菌混合接入后，混合菌斑整体变小，集中附着于根系周围，植株生长健康(图3F)。以上结果表明，阿氏芽孢杆菌R-B-01、棘孢木霉R-F-01在蓝莓根系周围对禾谷镰刀菌R-F-02有明显的抑制作用。

A：对照组； B：接入阿氏芽孢杆菌R-B-01； C：接入棘孢木霉R-F-01；D：接入禾谷镰刀菌R-F-02(无伤口)； E：接入禾谷镰刀菌R-F-02(有伤口)； F：接入混合菌；细实箭头为阿氏芽孢杆菌R-B-01，粗实箭头为棘孢木霉R-F-01，虚线箭头为禾谷镰刀菌R-F-02图3 3种微生物接入20 d后在蓝莓根系的定殖情况

A1、A2：对照组；B1、B2：接入阿氏芽孢杆菌R-B-01；C1、C2：接入棘孢木霉R-F-01；D1、D2：接入禾谷镰刀菌R-F-02(无伤口)；E1、E2：接入禾谷镰刀菌R-F-02(有伤口)；F1、F2：接入混合菌；细实箭头为阿氏芽孢杆菌R-B-01，粗实箭头为棘孢木霉R-F-01，虚线箭头为禾谷镰刀菌R-F-02图4 体式显微镜观察蓝莓根系

2.3 体视显微镜分析3种微生物在蓝莓根表的相互作用

为分析3种微生物在蓝莓根表的相互作用，采用体视显微镜观察上述处理组的根系、单菌落及混合菌落的定殖情况。结果显示，对照组根系颜色较浅、生命力旺盛、无明显分枝(图4A1、A2)。与对照组相比，单独接入阿氏芽孢杆菌R-B-01、棘孢木霉R-F-01及禾谷镰刀菌R-F-02(无伤口)后，根系均产生较多分枝(图4B1、B2—D1、D2)，其中，接入棘孢木霉R-F-01的根系产生的分枝数量是最多的。接入阿氏芽孢杆菌R-B-01后，白色菌落密集附着在根表面，根系颜色加深(图4B1、B2)；接入棘孢木霉R-F-01后，霉菌菌丝包裹根系，孢子生长旺盛(图4C1、C2)；接入禾谷镰刀菌R-F-02后，根系(无伤口)表面有镰刀菌菌丝缠绕，颜色变为红色，且有腐烂趋势(图4D1、D2)；在有伤口根系接入禾谷镰刀菌R-F-02后，发现菌丝侵入根系，根系明显变黑、腐烂、干枯，植株死亡(图4E1、E2)。与接入单菌落相比，接入混合菌(1∶1∶1)后，根系表面有一定的棘孢木霉孢子团定殖，禾谷镰刀菌R-F-02定殖量明显减少，根系未见发病且变得强壮(图4F1、F2)。以上结果表明，阿氏芽孢杆菌R-B-01、棘孢木霉R-F-01及禾谷镰刀菌R-F-02都有刺激蓝莓根系分枝的作用，其中棘孢木霉R-F-01刺激作用相对最强，阿氏芽孢杆菌R-B-01和棘孢木霉R-F-01在根表对禾谷镰刀菌R-F-02有明显的抑制作用。

2.4 电子显微镜分析3种微生物在蓝莓根表的相互作用

为进一步研究3种微生物在蓝莓根表的相互作用，采用电子显微镜观察上述处理组的根系。结果发现，对照组根系表面干净，具有规则性的起伏波动(图5(A))；接入阿氏芽孢杆菌R-B-01后，阿氏芽孢杆菌R-B-01以菌落团的形态密布在根表，但对根系无明显影响(图5(B))；接入棘孢木霉R-F-01后，霉菌孢子团紧凑分布在根系表面，尤其在根表有皱褶的区域孢子团密集定殖(图5(C))；接入禾谷镰刀菌R-F-02后，菌丝成带状缠绕在根(无伤口)表面(图5(D))，而在有伤口的根系中，带状菌丝侵入根系内部，根系遭到破坏(图5(E))。接入混合菌后，根系表面大面积被棘孢木霉R-F-01孢子团定殖，且少量禾谷镰刀菌R-F-02带状菌丝也被棘孢木霉R-F-01包裹起来。空间上，棘孢木霉R-F-01占据了主导地位，禾谷镰刀菌R-F-02占据从属地位，未观察到阿氏芽孢杆菌R-B-01的菌落团(图5(F))。以上结果表明，棘孢木霉R-F-01是混合菌中抑制禾谷镰刀菌R-F-02的主要菌种，且棘孢木霉R-F-01与禾谷镰刀菌R-F-02在蓝莓根表存在竞争关系。

细实箭头为阿氏芽孢杆菌R-B-01，粗实箭头为棘孢木霉R-F-01，虚线箭头为禾谷镰刀菌R-F-02图5 电子显微镜观察蓝莓根系

2.5 生防菌株抑制率测定

从表1和图6可知，两个处理组的病原菌菌落直径显著低于对照组，对禾谷镰刀菌R-F-02均具有明显抑制效果。其中菌株棘孢木霉R-F-01组抑菌圈最宽(图6(c))，抑制圈直径达到(0.80±0.17) cm。阿氏芽孢杆菌R-B-01和棘孢木霉R-F-01抑制率分别为91.31%、98.46%。

(a)对照组 (b)阿氏芽孢杆菌R-B-01 (c)棘孢木霉R-F-01 图6 生防菌抑制效果

表1 生防菌抑菌作用测定

3 讨论

镰刀菌是引起蓝莓根腐病的主要病原菌，严重影响蓝莓产业发展。生物防治具有高效、无害、环保等优势，逐渐成为植物病害防治的关键环节。本研究前期发现三叶草根表微生物在蓝莓根表具有较好的生防作用，而具体机制并不清楚。因此，从三叶草根表分离并纯化该微生物，命名为真菌R-F-01，通过形态学和分子生物学鉴定为棘孢木霉。许多研究报道，木霉(Trichoderma)对镰刀菌具有较强的抑制作用。黄远迪等[20]对一株从土壤中分离出的棘孢木霉GX004的研究表明，当棘孢木霉GX004孢子浓度为1.65×106个/mL时，尖孢镰刀菌几乎无法生长。YU等[21]研究发现拟康宁木霉菌(T.koningiopsis)通过调节活性氧代谢、渗透势和根际微生物群落，抑制尖孢镰刀菌引起的马尾松幼苗萎蔫。林辉等[22]发现棘孢木霉T-1、超微粉腐殖质及其复配物(腐殖质-T1)均能抑制连作土壤中尖孢镰刀菌的生长。PIMENTEL等[23]研究发现，哈茨木霉在大豆根系对镰刀菌的防治率高达92%，其机制与真菌寄生和诱导植物防御基因表达相关。侯瑞等[24]对80株蓝莓根际土壤真菌的研究显示，对蓝莓根腐病病菌抑制率在50%以上的菌株有22株，抑制率在70%以上的有8株，其中日本曲霉(Aspergillusjaponicas)、棘孢木霉和盖姆斯木霉(T.gamsii)菌株抑制效果最好，表现出良好的生防应用前景。关于木霉在植物根际对镰刀菌的生防作用研究较为广泛，而在植物根表的作用及机制尚不明确。

作为生防细菌，芽孢杆菌(Bacillus)被证明能够有效抑制镰刀菌的生长[25-27]。LIU等[28]研究显示，解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)通过促进黄瓜根系棉子糖的分泌减少，从而抑制镰刀菌的生长。PALMIERI等[29]利用解淀粉芽孢杆菌、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)、水生拉恩氏菌(Rahnellaaquatilis)和粘质沙雷菌(serratiamarcescens)微生物联合体有效控制了镰刀菌病原体。RUIZ等[30]发现短小芽孢杆菌(B.pumilus)可通过真菌互作、固氮、解磷、解钾等作用，提高根际的土壤营养达到增强植物抗逆性的作用。目前关于芽孢杆菌生防作用的研究多集中在植物根际，而在根表的作用及机制尚不清楚。

本研究将阿氏芽孢杆菌R-B-01、棘孢木霉R-F-01与禾谷镰刀菌R-F-02三种微生物接入蓝莓根系，并采用体式显微镜和电子显微镜分析三种微生物在根表的相互作用。结果表明，阿氏芽孢杆菌R-B-01、棘孢木霉R-F-01在蓝莓根周围和根表对禾谷镰刀菌R-F-02均有明显的抑制作用，阻止了禾谷镰刀菌R-F-02对根系的侵蚀和毒害，且体式显微镜分析结果还发现3种微生物均具有刺激蓝莓根系分枝的作用，其中以棘孢木霉R-F-01作用效果最强，分析其原因可能是菌株通过刺激植物根系，影响植物激素水平变化从而促进分枝发育，这需要后续进一步研究。电子显微镜分析进一步表明，在蓝莓植物根表棘孢木霉R-F-01是混合菌中抑制禾谷镰刀菌R-F-02的主要菌种，其机制是通过空间竞争的方式发挥作用的，这与其他研究报道的生防菌自身的杀菌活性[31]或刺激植物发生变化而发挥抑菌作用[32]的机制是不同的，而未观察到阿氏芽孢杆菌R-B-01可能是由于其竞争能力相对较弱导致的，其具体原因需后续探究。平板对峙实验中由于微生物空间结构较单一，两种有益菌对病原菌产生了拮抗。而在蓝莓根表不同，根表是有皱褶空间的结构，微生物孢子的形态决定了真菌对根系的亲和力，进而决定了优势真菌在根表的竞争力。同样，棘孢木霉R-F-01利用自身孢子优势迅速占据有利位点，缩小了禾谷镰刀菌R-F-02的生存面积，抑制病原菌生长。而关于棘孢木霉R-F-01在蓝莓根表是否对禾谷镰刀菌R-F-02产生拮抗作用，需后续探究。

综上，本研究从三叶草根表分离并鉴定出一株棘孢木霉R-F-01，并首次揭示阿氏芽孢杆菌R-B-01和棘孢木霉R-F-01可通过空间竞争的方式在蓝莓根表发挥生防作用，其中棘孢木霉R-F-01的作用效果最好，其田间防治效果和安全性评价需要后期的研究和验证。此外，阿氏芽孢杆菌R-B-01、棘孢木霉R-F-01和禾谷镰刀菌R-F-02刺激根系产生分枝的机制以及混合菌中阿氏芽孢杆菌R-B-01在根表的竞争能力需要深入研究。