李宜铮 乌素 高瑞霞 郝钢＊

1 内蒙古自治区药品检查中心 （内蒙古 呼和浩特 010020）

2 内蒙古农业大学食品科学与工程学院 （内蒙古 呼和浩特 010018）

3 内蒙古自治区药品检验研究院 （内蒙古 呼和浩特 010020）

内容提要：对常用防疫用医疗器械的微生物性能指标、检验方法和生物安全实验室设置等指标的检验标准进行比较，为给医疗器械生产企业建设微生物检验实验室、建立检验体系提供建议，并对医疗器械监督管理人员进行核查时提供工作参考。

为应对新冠肺炎疫情的发生发展，全国防疫物资生产积极，口罩、防护服生产企业数量急速增长。应急期间，大量原非医疗器械生产企业转产医疗器械。随着疫情防控进展，对医疗器械企业的监管、对防疫物资质量监督也更加严格。在对生产企业进行注册质量管理体系核查或监督检查过程中发现，某些转型企业在生产防疫物资时，对其性能指标中微生物性能检验的了解不是非常清晰。本文旨在给医疗器械生产企业建设微生物检验实验室、购买微生物检验用硬件、耗材以建议，并对医疗器械监督管理人员在对生产企业进行核查或检查时提供工作参考。

1.防疫用医疗器械的微生物性能指标及检验方法要求

1.1 常见防疫物资的微生物性能指标及检验方法

疫情期间，需求量较大的防疫物资为一次性使用医用口罩、医用外科口罩、医用防护口罩及医用一次性防护服，其产品标准中对产品微生物性能指标及检验方法的要求见表1。

表1.产品标准中微生物性能指标及检验方法的要求

由表1可见，除一次性使用医用口罩的标准为推荐性标准外，其余标准均为强制性标准，需要强制执行。四种防疫产品微生物限度检查的方法均为GB 15979-2002[5]，其附录B中规定了细菌菌落总数、大肠菌群、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、真菌菌落总数的检验方法以及最终的结果判定依据，所用培养基的配置方法载于附录G。需要注意的是，该标准并未对培养基适用性验证提出要求，也未对检验时阳性对照样品做出规定，故在注册质量管理体系核查中通常会建议生产企业在依此标准检验产品微生物限度的同时增加阳性对照样品，避免假阴性结果的出现。

1.2 检验方法要求

1.2.1 无菌检查环境要求和供试品数量

具有无菌要求的产品，无菌检查法对试剂、稀释液、培养基、供试液制备、接种、培养和观察及结果判定均要求符合《中国药典》的相关内容，而对无菌检验环境的要求、供试品数量可参考GB/T 14233.2-2005[6]中第三章的方法，也可参考《中华人民共和国药典》[7]（简称，《中国药典》）2020年版四部的内容，二者的要求差异见表2。

表2.两个标准对无菌检查环境要求和供试品数量要求的区别

由表2所示，现行《中国药典》对无菌检查的环境要求远远高于GB/T 14233.2-2005的要求，《中国药典》2020年版四部9205《药品洁净实验室微生物检测和控制指导原则》中表3对各洁净级别空气悬浮粒子做出要求，B级洁净环境在静态条件下≥0.5μm的粒子数限值为3520，≥5.0μm的粒子数限值为29，在动态条件下≥0.5μm的粒子数限值为352000，≥5.0μm的粒子数限值为2900；A级洁净环境在静态条件下≥0.5μm的粒子数限值为3520，≥5.0μm的粒子数限值为20，在动态条件下≥0.5μm的粒子数限值为3520，≥5.0μm的粒子数限值为20；可见B级背景下的A级单向流洁净区域可以理解为静态100级下的动态100级，其一般实现方法为在层流洁净室或大换气次数的乱流洁净室内安装层流罩或超净台，在层流罩下或超净台内操作。而GB/T 14233.2-2005[5]仅对进行试验局部洁净级别和气流方向提出要求，YY/T 0033-2000《无菌医疗器具生产管理规范》[8]附录A中表A1的要求，100级洁净环境中≥0.5μm的粒子数限值为3500，≥5.0μm的粒子数限值为0，未明确是否为动态条件，且对周边环境没有明确要求。在已作废的《关于实施<医疗器械生产质量管理规范（试行）>及其配套文件有关问题的通知》（国食药监械[2011]54号）文件第四条曾规定“医疗器械生产企业的无菌检测实验室原则上应设3间万级下的局部百级洁净室，用作无菌室、阳性对照室和微生物限度室”，对检验是百级单向流环境的周边环境做出了规定，但正式公布的《医疗器械生产质量管理规范》[8]及其附录中均未对相关内容作出规定。对供试品数量的要求，GB/T 14233.2-2005中最小检验量为3个最小销售单元包装，而中国药典规定最小检验量为4个最小销售单元包装。

虽然《中国药典》对无菌检验的环境及供试品数量要求上更为严格，但考虑到药品与医疗器械产品在体积、单件产品的质量等特性不同，按照GB/T 14233.2-2005的要求设置无菌检验环境和决定供试品数量仍然是可以接受的。

1.2.2 培养基要求

在对无菌防疫用医疗器械生产企业进行现场检查时，应注意GB/T 14233.2-2005中3.5条对培养基要求其制备方法、灵敏度检查及其他各项要求均需符合《中国药典》的要求，现行《中国药典》中对培养基的适用性检查包括无菌性检查和灵敏度检查，灵敏度检查需要使用金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌及黑曲霉菌株，进行注册质量管理体系现场核查时，应考察企业是否购买了上述菌种，是否建立了菌种的使用台帐以及是否保留了购买记录。同时《中国药典》对培养基灭活凝固后的pH也有要求，除配备普通pH计用以测量配置时培养基的pH，还应配备可测定灭活后凝固的固体培养基的pH计或探头。

1.2.3 其他要求

现场检查时，除需要注意企业是否具有进行微生物检验的硬件条件外，还需要核查企业是否具有进行培养基验证、方法学验证的实际操作能力。若产品的微生物要求符合GB/T 14233.2或《中国药典》，其中规定进行培养基适用性验证及方法学验证接入的阳性菌不超过100CFU，故企业在进行相关试验时，可以直接选择已经定量的冻干复溶菌（见图1a），按照说明书操作，将复溶后的菌液直接接入培养基或者含有供试品的培养体系即可。但此类定量冻干菌种较为昂贵，各生产企业通常选择试管琼脂斜面上保存的菌株作为菌种（见图1b），若使用该菌种，则需要将购买来的菌株由琼脂斜面接种到相应培养基中复壮，复壮后的菌液逐级比例稀释并培养之后计数，找出每毫升菌落总数约在50～100CFU的稀释级，将该稀释液接入培养基或含供试品的培养体系。使用第二种操作方法时，需要经过至少2次培养，1次计数，在进行现场检查时，需要考察相关培养基的配置记录，菌生长的观察记录，计数记录以及相关培养箱、计数器的使用记录等，以验证企业具有培养基验证及方法学验证的微生物操作能力。另外需要关注的是，此种方式提供的菌种一般为第2代，复壮后的菌液为第3代，《中国药典》对所使用工作菌的要求为不超过5代。

图1.工作菌的两种提供形式

方法学验证的内容主要是确定产品在《中国药典》规定的试验体系下，无菌试验方法的准确性、精密度是否可以满足试验要求。对于常见的具有无菌要求的防疫物资，进行无菌检验的方法一般有直接接种法和薄膜过滤法，前者为将样品直接投入培养基，后者为将样品经无菌缓冲液洗脱，洗脱液经薄膜过滤后将滤膜培养。无论使用上述何种方法，首先需要解决的就是样品代表性的问题，因两种防疫物资体积均较大，尤其以防护服为甚，无法直接投入培养基或进行洗脱操作，故需要在一个最小销售单元包装中选择最不易灭菌的部分或部位作为整个样品的代表，具体选择哪些部位或者部分，则需要生产企业对产品进行研究，并在产品技术要求的相关检验方法及检验作业指导书中予以明确。在进行质量管理体系现场核查时，部分生产企业以最终产品是否符合无菌要求作为放行条件之一，但企业为了加快出货速度，使用环氧乙烷灭菌的产品经常在未进行完环氧乙烷解吸附工艺前，即进行产品的无菌检验。若如此操作，则应对供试品中残留的环氧乙烷是否会在培养体系中发挥抑菌作用进行验证，并采取措施消除抑菌影响。因环氧乙烷具有极易溶于水的特性，通常采用的方法为稀释法和薄膜过滤法，稀释法即在供试品加入量不变的前提下，将培养基的量逐级扩大，直至找到环氧乙烷不会抑制培养系统中微生物生长的培养基的量。无论采取何种方法，均应在产品检验作业指导书中做出明确规定，并在设计开发文档中保留相关记录。

2.生物安全实验室（阳性间）的设置

由上文可知，无菌医疗器械的无菌检验需要符合《中国药典》的相关规定，其中培养基适用性验证、供试品检验方法学验证以及试验过程中的阳性对照样品的配置均需要对阳性菌进行操作，即需要配备生物安全实验室，而现行《医疗器械生产质量管理规范》及其附录、强制性国家标准对防疫物资检验需要配备生物安全实验室的等级、配置及其洁净度要求等均未做出明确规定，因此根据进行相关微生物实验所需实际操作，明确生产企业设置微生物阳性间的最基本条件。

中华人民共和国药典2020年版四部[7]中1101、1105、1106及GB 15979-2002[5]四种微生物检查法所使用阳性微生物见表3，根据《人间传染的病原微生物名录》[9]，其对应的危害级别及实验活动所需生物安全实验室级别见表3。

表3.无菌及微生物限度检查法所用阳性菌危害级别及操作基本条件

由表3可知，进行防疫物资微生物检验所用致病微生物最高危害等级为第三类，可在2级生物安全试验条件下进行操作，部分阳性菌为非致病菌，未列入目录，其亦可在2级生物安全试验条件下操作。但对于2级生物安全试验条件及其环境的洁净程度、相对外界的压力差以及通风、换气等指标，《中国药典》在9205《药品微生物实验室质量管理指导原则》中仅要求生物安全控制区域应配备满足要求的生物安全柜，以避免有危害性的生物因子对实验人员和实验环境造成危害，而GB 15979-2002未做出明确要求。所以需要参考其他标准及规范对阳性间的详细配置做出进一步研究。

GB 19489-2008《实验室生物安全通用要求》[10]中对BSL-2实验室的核心要求为“6.2.6应在操作病原微生物样本的实验间内配备生物安全柜”及“6.2.7若生物安全柜的排风在室内循环，实验间应具有通风措施，如进行管道排风，则应独立于建筑物其他排风设施”，同样未对使用何种生物安全柜及安全柜的周边环境作出规定。

GB 50346-2011《生物安全实验室建筑技术规范》[11]中3.3.1指出，BSL-2实验室宜实施操作者与被操作对象之间的隔离和生物安全实验室与外部环境的隔离，具体的隔离措施见表4。

表4.1级及2级生物安全实验室二级屏障的主要技术指标

由表4可知，BSL-2实验室对实验室与外界环境隔离可以认为是无特殊要求，且可共用建筑物，与建筑物其他部分可相通，但应设可自动关闭的带锁的门。对于生物安全柜的选择，生物安全实验室建筑技术规范从被保护的对象是操作者还是样品、保护人员的安全水平及所操作的样品是否具有挥发性这三方面给出了选择生物安全柜的基本原则，但仍未明确BSL-2实验室应选用的生物安全柜类型。

2017年发布、2018年实施的WS 233-2017《病原微生物实验室生物安全通用准则》[12]因其发布时间较晚，编制过程中充分参考了上述标准的内容，对BSL-2生物安全实验室所配置的生物安全柜应为Ⅱ级做出了明确要求，故结合上述标准，对按照GB 14233.2-2005及GB 15979-2002、YY 0569-2011《Ⅱ级生物安全柜》[13]标准进行无菌及微生物限度检验的产品所需要操作阳性菌的危害级别，BSL-2阳性间的基本配置条件为：应具备Ⅱ级生物安全柜（A1、A2、B1、B2）、对洁净度水平无要求、对相连通房间的最小负压差无要求、相对于大气的最小负压无要求、可采用自然通气开窗通风、对换气次数无要求，设有可自动关闭的带锁的门。

但在对生产企业进行核查时，往往很少见到按此基本要求设置阳性间的情况，主要原因一是生产企业并未对此基本配置的来源和理论依据进行深入了解，二是生产企业基于对阳性菌意外溢洒时降低对阳性间外污染概率的考虑，对阳性间进行了机械通风。需要注意的是，若采用机械通风，则应避免气流流向导致的污染和避免污染气流在实验室之间或与其他区域之间串通而造成交叉污染，即机械通风的排风系统应独立于其他实验室的空调系统，避免排出的风成为回风的一部分，同时根据GB 50346-2011[11]中条文说明的建议，若BSL-2实验室设置了机械通风，则应保证主实验室及其缓冲间相对大气为负压，并保证气流从辅助区流向防护区，主实验室相对大气压力最低。同时需要关注，若使用B型Ⅱ级生物安全柜或为A型Ⅱ级生物安全柜设置了排风罩，则排风口也需独立设置。

综上所述，本文对防疫物资微生物检验时需要关注的几点问题进行了梳理和论证，希望能指导企业建立完善的微生物检验能力，同时作为医疗器械监管人员在进行检查时的参考。