陈桂平，付戴波，钟志勇，刘兰平，涂群，许翔，杨珍

（1.江西省养蜂研究所，江西南昌 330200；2.九江市畜牧兽医局；3.江西省农业技术推广中心；4.南康区农业农村局）

黄芩、黄连、金银花、蒲公英都是清热解毒的常用中药，来源广泛，价格低廉，但目前它们用于蜜蜂疾病防治方面的研究未见报道。

在前期研究中发现黄芩、黄连、金银花、蒲公英4种单味药材对蜂房球菌表现出一定的抑菌作用，为增强它们的抑菌效果，需对4味药材进行组方研究，筛选出最优组方，为后续开发新药提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试药材。黄芩、黄连、金银花、蒲公英均由江西某生物工程公司提供，药材经检定，均符合生药质量标准。

1.1.2 培养基。液体培养基由蛋白胨1g、半胱氨酸0.02g、葡萄糖0.5g、果糖0.5g、可溶性淀粉1g组成，加纯化水至100mL（用1mol/L KH2PO4调pH至6.6）；固体培养基由液体培养基加琼脂2g组成，制法一致。

1.1.3 菌株。蜜蜂蜂房球菌（编号：181006），购于中国兽药监察所。

1.2 方法

1.2.1 中药提取物的制备。水提取法[1]：分别称取黄芩、黄连、金银花、蒲公英各100g，加入蒸馏水至500 mL，浸泡30min，沸腾后用文火煎煮45min，用4层纱布过滤，药渣加500mL蒸馏水再煎煮30min。合并3次滤液，减压浓缩成膏状，低温干燥后，得提取物，计算得膏率，灭菌备用。临用前，准确称取提取物加无菌蒸馏水配成生药含量为2g/mL的药液。醇提法[2]：将黄芩、黄连、金银花、蒲公英粉碎成粗粉（过40目筛），各称取粉末100g，用70%的乙醇400 mL浸泡3次，第1次浸泡30h，第2、3次各浸泡15h，过滤，合并3次滤液，减压浓缩至膏状，低温干燥后，得提取物，计算得膏率，灭菌备用。临用前，准确称取提取物加无菌蒸馏水配成生药含量为2g/mL的药液。

1.2.2 菌液的制备。将菌种复苏后，接种至液体培养基，在加10%CO2的厌氧条件下，35℃培养24h～48h。测定菌数后，用无菌生理盐水稀释成菌悬液，使活菌数相当于2×108CFU/mL，备用。

1.2.3 抑菌直径测定。参照NCCLS纸片扩散法[3],取琼脂固体培养基26mL倒入灭菌平皿内，凝结后加入0.2mL菌液涂布均匀。取经灭菌的标准滤纸片，每张滴加药液20μL后贴于平板表面，设置两个平行一个空白，于加10%CO2的厌氧条件35℃培养24h，观察结果，测量抑菌圈直径（mm）。抑菌圈直径大于或等于8mm为高度敏感、6～8mm为中度敏感、6mm以下为耐药或不敏。每种药材做3次重复。

1.2.4 最低抑菌浓度（MIC）的测定。参照NCCLS稀释法[4]，取灭菌具塞试管13支，除第1管加入1.6mL液体培养基外，其余每管加入液体培养基1.0mL，在第1管加入受试药液原液0.4mL混匀，然后吸取1.0mL至第2管，混匀后再吸取1.0mL至第3管，如此倍比稀释至第11管，并从第11管中吸取1.0mL弃去，第12管为不加药液的细菌生长管（阳性对照），第13管加药液1.0mL,混匀后弃去1.0mL，作为药液阴性对照；取细菌稀释液0.1mL，分别加入上述1～12管中混匀，13号管加0.1mL灭菌生理盐水，然后各管置于加10%CO2的厌氧条件35℃培养24h后观察结果。若培养基混浊，表示有细菌生长，若培养基完全清亮，表示无细菌生长。以抑制试验菌生长的最高稀释度为MIC（最低抑菌浓度）。

1.3 组方筛选

通过采用正交试验来评价不同提取物组方对蜂房球菌的抑菌效果，筛选出最优组方[5～6]。采用L9(34)正交表进行试验，将纸片法测定的抑菌效果好的提取物作为评价因素，设置以提取物1、2、3倍MIC为水平，各因素和水平见表1。

表1 不同提取物L9(34)正交试验因素水平表

2 结果与分析

2.1 不同提取物的抑菌敏感性

分别采用水提法和醇提法提取黄芩、黄连、金银花、蒲公英，获得8种不同提取物。由表2结果可知，8种不同提取物中，黄连醇提物和蒲公英水提物对蜂房球菌的敏感性较差，其他6种提取物均表现出一定的抑菌效果，以黄芩水提物的抑菌力为最强（D＞13mm），8种不同提取物抑菌力由大到小为：黄芩水提物＞金银花醇提物＞黄芩醇提物＞黄连水提物＞蒲公英醇提物＞金银花水提物＞黄连醇提物＞蒲公英水提物；黄芩水提物和醇提物、黄连水提物、金银花醇提物为高度敏感，金银花水提物和蒲公英醇提物为中度敏感，黄连醇提物、蒲公英水提物为耐药或不敏感；黄芩和黄连水提物抑菌性＞醇提物、金银花和蒲公英醇提物抑菌性＞水提物。

表2 不同提取物的抑菌敏感性 mm

2.2 不同提取物的最低抑菌浓度

采用二倍稀释法分别测定8种不同提取物的最低抑菌浓度（MIC），从表3结果可知，8种不同提取物中，黄芩水提物的最低抑菌浓度为1.56mg/mL，蒲公英水提物的最低抑菌浓度超过400mg/mL，8种不同提取物抑菌力基本与纸片法测定结果一致，抑菌力由大到小为：黄芩水提物＞金银花醇提物＞黄芩醇提物＞黄连水提物＞蒲公英醇提物＞金银花水提物＞黄连醇提物＞蒲公英水提物。

表3 不同提取物的最低抑菌浓度 mg/mL

2.3 组方筛选结果

通过L9(34)正交试验表安排4因素3水平试验对不同提取物组合进行优化。由表4结果可知，对蜂房球菌抑菌效果影响因素的排序为A＞D＞B＞C，因素A和D在复方中对蜂房球菌的抑制作用起着主要作用。综合考虑各因素水平，确定抑制蜂房球菌的最优组方为：A3B2C1D1。

表4 不同提取物L 9(34)正交试验结果 mg/mL、mm

3 讨论

在8种不同提取物中，黄芩水提物抑菌力最强，抑菌圈直径超过13mm，抑菌力由大到小是黄芩水提物＞金银花醇提物＞黄芩醇提物＞黄连水提物＞蒲公英醇提物＞金银花水提物＞黄连醇提物＞蒲公英水提物；确定的最优组方是由黄芩水提物、黄连水提物、蒲公英醇提物、金银花醇提物按4.68:12.5∶3.125∶3.125比例组成。

同一种药材，提取方法不同，抑菌效果有明显差异，如对同一种病原菌，黄芩和黄连水提物抑菌性＞醇提物、金银花和蒲公英醇提物抑菌性＞水提物。差异产生的原因主要在于不同提取工艺，提取出的主要成分不同。水提法有利于水溶性成分的释放，醇提法有利于脂溶性成分的释放。在制剂生产时，必须充分考虑到这种提取工艺带来的差异。