□ 凌 赏 何洁银 曾美琪 韩山师范学院生命科学与食品工程学院 任嘉平 丁 心 河源市国柠现代农业研究院

何沛琪 张淑婷 冯金玲 章 斌 韩山师范学院生命科学与食品工程学院

蜜兰香单丛属产自广东潮州凤凰山的单丛茶系列，其成品茶蜜香持久，属于浓香型茶叶[1]。蜜兰香含较高的茶多糖、生物碱、茶多酚和氨基酸等生物活性物质[2-3]。目前，茶多糖的提取方法主要有酸或碱提取法、水提醇沉法、微波辅助提取法、酶提取法、超声波提取法等[4]。各种方法的提取效率和对茶多糖抗氧化等功能活性的影响不一，目前，有关蜜兰香型单丛茶粗多糖提取及抗氧化活性的研究相对较少，因此，本文采用水提醇沉法对蜜兰香型单丛茶粗多糖的提取条件进行优化[5]，并测定其抗氧化活性，以期为蜜兰香单丛茶粗多糖的综合利用提供一些试验参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂

蜜兰香型单丛茶：购自潮州市饶平县黄冈镇清心茶社。无水乙醇、葡萄糖、浓硫酸、苯酚、硫酸亚铁、抗坏血酸（VC）、水杨酸、铁氰化钾、氯化铁等：均为分析纯。

1.2 仪器设备

N-1100型旋转蒸发仪：上海爱朗仪器有限公司；HWS-24型电热恒温水浴锅：上海一恒科学仪器有限公司；722型可见分光光度计：上海舜宇恒平科学仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 茶样品处理与水提醇沉法提取粗茶多糖

蜜兰香茶叶粉碎后过60目筛，将茶粉与蒸馏水按一定比例（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40），于不同提取温度（50 ℃、 60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃和100 ℃）、不同提取时间（40 min、60 min、 80 min、100 min和120 min）和不同提取次数（1、2、3、4、5）下提取粗茶多糖，将提取液过滤、合并，旋转蒸发浓缩至一定体积后，加入3倍体积的无水乙醇，置于4 ℃冷藏12 h后离 心（3 000 r/min、10 min），取沉淀于40 ℃干燥，即得粗茶多糖。

1.3.2 粗茶多糖样品的测定

依据苯酚-硫酸法[6]进行测定，取0.5 mg干燥所得的粗茶多糖溶于40 mL去离子水中充分溶解，测定490 nm处的吸光度，根据葡萄糖标准曲线计算粗茶多糖得率。

1.4 抗氧化活性测定

1.4.1 羟基自由基清除能力的测定

配制浓度为1.0 mg/mL、2.0 mg/mL、3.0 mg/mL、4.0 mg/mL和5.0 mg/mL的多糖溶液和抗坏血酸溶液。用上述2.0 mL不同浓度的粗茶多糖液与 1.0 mL 9 mmol/LFeSO4、1.0 mL 9 mmol/L 水杨酸-乙醇溶液、1.0 mL 8.8 mmol/LH2O2混合后，37 ℃水浴30 min，测其吸光度A1。分别用同体积的去离子水和抗坏血酸溶液替代粗茶多糖液，按同样操作测定吸光度A0和A2，其分别为空白组和对照组。按式（1）计算羟基自由基清除率[7]：

1.4.2 还原能力测定

取不同浓度的粗茶多糖溶液和抗坏血酸溶液0.75 mL于试管中，依次加入0.75 mL0.2 mol/L磷酸盐缓冲液（pH=6.6）和0.75 mL1%铁氰化钾溶液，50 ℃水浴20 min后快速冷却；再加入0.75 mL10%三氯乙酸溶液与其反应，4 ℃下8 000 r/min离心 10 min后取上清液1.5 mL，加入8 mL去离子水和0.5 mL0.1%氯化铁溶液，混匀静置10 min，测700 nm处的吸光度。

1.5 数据处理与统计分析

采用Excel进行数据处理和使用SPSS17.0进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖标准曲线

由图1可知，葡萄糖标准曲线的实验结果具有良好的线性关系。

图1 葡萄糖标准曲线图

2.2 单因素试验

2.2.1 不同料液比对粗茶多糖提取率的影响

由图2可知，粗茶多糖提取率随蒸馏水的添加量增多呈现先下降后上升再下降趋势。当料液比为1∶20时，粗茶多糖提取率达到最高0.23%。因此选择1∶20为最佳料液比。

图2 不同料液比对粗茶多糖提取率的影响

2.2.2 不同提取时间对粗茶多糖提取率的影响

由图3可知，随浸提时间的延长，粗茶多糖提取率不断增加，当提取时间超过80 min时，提取率随时间延长的增加趋于缓慢。因此确定最佳浸提取时间为80 min。

图3 不同提取时间对粗茶多糖提取率的影响

2.2.3 不同浸提次数对粗茶多糖提取率的影响

由图4可知，浸提1次时的粗茶多糖得率明显较低，当浸提次数为2时，粗茶多糖得率达到最大。当浸提2次以上时，粗茶多糖得率无明显增加。从生产角度考虑到浸提次数可能引起的成本、时间、能耗增加，因此，选择浸提次数为2次最好。

图4 不同浸提次数对粗茶多糖提取率的影响

2.2.4 不同浸提温度对粗茶多糖提取率的影响

由图5可知，粗茶多糖提取率随浸提温度升高而随之增加，且在80 ℃之后呈相对更大的增加速率。当温度超过90 ℃时，提取率增加速率变小。考虑到温度过高对多糖活性的负面影响以及高能耗，确定最佳浸提温度为90 ℃。

图5 不同浸提温度对粗茶多糖提取率的影响

2.3 正交试验

在单因素试验基础上，以料液比、提取时间、提取温度为因素，开展L9（34）正交优化试验。正交因素水平表和正交试验结果如表1所示。

由表1可知，影响粗茶多糖提取率的因素次序为：浸提温度＞提取时间＞料液比，其工艺的最佳组合为A1B2C3，即料液比为1∶15，浸提时间80 min，浸提温度为100 ℃。与正交试验组中的A1B2C2比较验证，得到A1B2C3组合条件下的粗茶多糖提取率为0.318%。

表1 正交因素水平表和正交试验结果表

2.4 抗氧化活性评价

2.4.1 羟基自由基清除能力的测定

由图6可知，羟基自由基清除率随粗茶多糖浓度的增加而相应增大，当粗茶多糖浓度为5 mg/mL时，羟基自由基的清除率达到81.72%。且不同浓度的粗茶多糖对羟基自由基清除能力均高于对应浓度的抗坏血酸。这可能是由于粗茶多糖中还含有茶多酚、儿茶酚、咖啡碱等具有较强抗氧化能力的活性物质，与粗茶多糖共同表现出协同增强的抗氧化效应。

图6 单丛茶粗茶多糖羟自由基清除能力

2.4.2 粗茶多糖还原能力测定

粗茶多糖可将Fe3+还原成Fe2+，中断其氧化反应。由图7可知，随着浓度的增加，粗茶多糖的还原能力也逐渐增强，且在4 mg/mL浓度以下时，抗坏血酸的还原能力明显高于粗茶多糖。随着两者浓度的进一步增大，粗茶多糖的还原能力超过抗坏血酸。

图7 单丛茶粗茶多糖还原能力

3 结论

通过单因素和正交优化试验，确定了蜜兰香型单从茶粗茶多糖的最佳提取条件为料液比1∶15，浸提时间80 min，浸提温度100 ℃，浸提次数2次，粗茶多糖得率为0.318%，且所提粗茶多糖具有较好的抗氧化活性，羟自由基清除率可达81.72%。