徐杰 王泽懿 刘文越 狄鲁滨 黄雨阳

摘要 以玉米农田土壤为筛选样本，以玉米秸秆为筛选碳源，通过多重筛选试验组合，成功构建一组高效降解纤维素的复合型菌剂Y8，并进行室内摇瓶试验、室外对比性坑试，从实际应用的角度探讨菌剂Y8的降解能力。经菌落和菌体形态观察及生理生化初步鉴定，这8株纤维素降解菌株均属于芽孢杆菌属（Bacillus sp.）。在摇瓶试验中，该菌剂对玉米秸秆的降解率达44.70%;田间试验中菌剂对秸秆的降解率可达60%以上。研究结果表明，菌剂Y8可明显提高玉米秸秆田间原位腐解效率，并在一定程度上抑制植物病原菌的生长。

关键词 复合型菌剂;原位腐解;酶解活力;玉米秸秆;研制;功能验证

中图分类号 S-141.4  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2021）13-0074-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.13.019

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Development and Functional Verification of in situ Decomposing Agent for Corn Stalk in the Field

XU Jie，WANG Ze yi， LIU Wen yue et al

（College of Resources and Environment， Northeast Agricultural University， Harbin， Heilongjiang 150030）

Abstract Taking corn farmland soil as the screening sample and corn straw as the carbon source，through multiple screening experiments， a group of compound bacterifier Y8 with high efficiency for cellulose degradation was successfully constructed.The indoor shaking bottle experiment and outdoor comparative pits were conducted to explore the degradation capacity of bacterifier Y8 from the perspective of practical application.The morphological observation and physiological and biochemical identification of the colonies and bacteria showed that all the 8 cellulose degrading strains belonged to Bacillus sp..In the flask shaking experiment， the degradation rate of the bacterial agent to corn straw was 44.70%.In the field experiment， the degradation rate of bacterial agent to straw could reach more than 60%.The research results showed that the fungus Y8 could significantly improve the efficiency of corn stalk decomposing in situ in the field， and inhibit the growth of plant pathogenic bacteria to a certain extent.

Key words Compound bacteria agent;Decomposing in situ; Enzyme activity;Corn straw;Development;Functional verification

玉米是东北地区种植面积最大的粮食作物，据统计，2018年黑龙江省玉米播种面积为631.7万hm2[1]。如此大量的玉米种植面积必然会导致收割后产生的玉米秸秆难以有效处理利用[2]。虽然秸秆作为可以直接利用的可再生资源，但目前最多的处理方式仍然是直接田间焚烧。秸秆焚烧加剧了空气污染，促使了“复合型雾霾”频发，浪费了秸秆中大量的有机营养物质[3-4]。为了减少此现象的发生，目前政府大力提倡将秸秆直接还田，但由于秸秆中含有大量的木质纤维素类物质，导致其自然腐解效率低，严重影响播种效果。该研究所研制的菌剂旨在提高玉米秸秆的田间原位腐解效率，同时降低玉米常见病害的感染率，改善土壤肥力，缓解秸秆焚烧带来的环境生态压力。

利用微生物本身或其代谢产物降解秸秆受到了学术界广泛的关注，目前对放线菌和真菌的筛选及研究较多[5]。王洪媛等[6]经过富集筛选、检测等一系列手段得到3株具有较强降解纤维素能力的真菌菌株;李文哲等[7]從腐烂的木材中分离出了4株纤维素分解真菌。国内用于处理秸秆等富含木质纤维素成分的物质时，大多应用真菌类菌剂尤其是以木霉属和曲霉属制得的菌剂为主。然而，真菌生长受水分严格限制，干燥条件下真菌的降解能力会明显减弱[5]。相反，细菌生长条件不同于真菌一般严格，且具有芽孢的细菌一般抗逆性较强，可在不良的环境条件下生长[8]。细菌中也不乏存在一些具有高效降解纤维素类物质能力的菌株，然而，对以细菌为主体纤维素降解菌剂报道相对较少。该研究利用富含纤维素降解菌的田间土壤对其进行富集处理及驯化培养，通过一系列生理生化检测获得具有高效降解能力的细菌菌株，并将其复配成菌剂，以摇瓶试验、田间坑试等方式对该复合菌剂进行功能验证。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 土样、试验用秸秆。

土壤样品采集自黑龙江省哈尔滨市郊区枯枝落叶覆盖较多的土壤、田间堆放玉米秸秆及种植玉米的土壤，表层土下5 cm处取样，4 ℃冰箱保存备用。试验使用的玉米秸秆收集于大田，长度为15～20 cm。

1.1.2 培养基。富集培养基：蛋白胨5 g、牛肉膏2.5 g、NaCl 2.5 g、秸秆粉20 g、琼脂20 g、去离子水1 000 mL。

纯化分离培养基：牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、琼脂20 g、去离子水1 000 mL。纤维素降解菌筛选培养基：CMC-Na 15 g、NH4NO3 1 g、MgSO4 0.5 g、KH2PO4 1 g、酵母膏1 g、琼脂20 g、去离子水1 000 mL。产酶培养基：MgSO4 0.3 g、FeCl3 0.01 g、NaCl 0.1 g、KH2PO4 1 g、NaNO3 2.5 g、CaCl2  0.1 g、秸秆粉20 g、蛋白胨1 g、去离子水1 000 mL。

1.1.3 植物病原菌。用于抑菌试验的植物病原菌包括玉米大斑病病原菌大斑病凸脐蠕孢菌[Exserohilum turcicum（Pass.）Leonard et Suggs]、玉米鞘腐病病原菌尖孢镰孢菌（F.oxysporum）。

1.1.4 摇瓶试验所用市售菌剂。农富康秸秆发酵剂（河南农富康生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 菌株的富集与初筛。称取5 g土壤样品加入富集培养基中，30 ℃、160 r/min的条件下进行反复多代驯化富集培养。将土壤悬液进行浓度梯度稀释并涂布于CMC-Na培养基，观察菌落周围透明圈的有无及大小，保留透明圈较大的菌株，三区划线纯化并保存。

1.2.2 菌株CMC/天然纤维素酶活力测定。将初筛所得菌株制成种子液，并按2.5%的比例分别接入产酶发酵培养基中，30 ℃、 160  r/min振荡培养， 每隔24 h取培养液，采用3， 5-二硝基水杨酸法（DNS）[8] 分别测定菌株CMC、天然纤维素酶活力。

1.2.3 菌株抑菌性检测。

将植物病原菌接种至PDA培养基一侧，待真菌菌丝蔓延至培养基50%时，将所得菌株分别接种于病原菌菌落1.0～1.5 cm处，观察细菌对病原菌生长抑制情况。

1.2.4 菌种鉴定。采用革兰氏染色法[9]、芽孢染色法[10]等对各功能菌株进行形态学、生理生化鉴定。

1.2.5 复合菌剂的构建。

1.2.5.1 拮抗试验。将菌株两两组合并在基础性培养基平板上交叉划线，37 ℃温箱培养24 h，观察菌体交叉处菌株的生长情况，若生长良好则说明两菌株之间不存在拮抗作用。

1.2.5.2 液体菌剂的制备及絮凝。将40 mL的种子液接入发酵培养基中，37 ℃、400 r/min的条件下扩大培养48 h。参考文献[11]进行发酵液絮凝处理并对絮凝后的物质进行刚果红检测。

1.2.6 复合菌剂的功能验证。

1.2.6.1 室内摇瓶試验。

称取复合菌剂、市售菌剂各0.5 g，加入150 mL蒸馏水使其溶解，并与20 g玉米秸秆混合于200 mL锥形瓶中，在30 ℃、160 r/min的条件下振荡培养。在摇瓶培养第10天、第20天、第25天、第30天、第40天分别取样，清洗，烘干，称重。

1.2.6.2 室外田间试验。

进行对比性室外坑试，分阶段观察秸秆形态变化。按表1中所示的用量将试剂加入高20 cm、长40 cm的土坑中，并覆土处理。在第30天、第45天、第60天分别测定土壤温度、玉米秸秆干重，试验于夏季5—7月进行。

其中，处理①，空白对照，只加入100 g玉米秸秆，其他试剂均不添加;处理②，在土坑中加入100 g玉米秸秆及所研制腐解菌剂10 g;处理③，加入100 g玉米秸秆、10 g所研制菌剂并添加营养液、水各1 000 mL;处理④，加入100 g玉米秸秆、1 000 mL水;处理⑤，加入100 g玉米秸秆、10 g所研制菌剂、1 000 mL营养液;处理⑥，加入100 g玉米秸秆、10 g所研制菌剂、1 000 mL水。

2 结果与分析

2.1 菌株初筛结果 采用刚果红染色法对富集所得菌株进行初筛，初步获得具有纤维素降解能力的菌株17株。结果见表2。

研究表明，在某种程度上菌株透明圈直径（D）与菌落直径（d）比值的大小能够代表菌株纤维素降解能力强弱，比值越大，纤维素降解能力越强[12]。如图1所示，菌株D10-1、菌株50-15的透明圈基本将整个培养基覆盖，D/d值分别达3.27、3.70，说明2个菌株在菌落较小时仍可形成较大直径的透明圈，具有较强分解羧甲基纤维素的能力。为进一步评估初筛所得菌株纤维素降解能力，对这17株菌株进行CMC酶活力、天然纤维素酶活力检测。

2.2 CMC酶活力、天然纤维素酶活力测定

刚果红染色法可以对菌株是否具有纤维素降解能力进行定性分析，不能保证筛选所得菌株在实际应用中具有良好的降解玉米秸秆能力[13]。为确保所筛选菌株降解的实际能力对菌株进行定量分析，根据定性及定量结果综合分析，挑选最适、分解能力最强的菌株。

通过对酶活力的测定数据（表3）及水解圈直径大小（表2）进行分析，选择其中8株具有较高活性菌株，分别为菌株D10-1、YD-1、50-15、BH5、A422、P3、P1、木13。

2.3 抑菌性检测

大斑病凸脐蠕孢菌、尖孢镰孢菌是导致玉米大斑病、玉米鞘腐病发生的主要病原菌，可造成玉米产量下降[14]。因此，对病原菌的防治是必要的。研究所筛选菌株对2株病原菌的生长抑制能力，结果如图2所示，病原真菌在菌株YD-1的菌落周围生长缓慢或停止生长，此现象表明菌株YD-1可明显抑制玉米大斑病、玉米鞘腐病等玉米易感病原菌的生长。这些具有良好抑菌效果的菌株在高效降解玉米秸秆的同时又可为玉米的栽种提供良好的生长条件，改善土壤环境。

2.4 菌株鉴定

通过菌落形态特征、生理生化特征观察对8株纤维素降解菌株进行鉴定，为进一步研究和利用所筛选菌株提供试验基础和理论依据。经菌落和菌体形态观察及生理生化初步鉴定（表4～5）， 8株纤维素降解菌株均属于芽孢杆菌属 （Bacillus sp.）。

芽孢是决定菌株抗逆性的关键因素，也是衡量菌株能否适应自然环境的重要指标[15]。由表5和图3可知，筛选到的8株细菌都存在芽孢这一特殊结构，具有一定抵抗不良环境的能力。

2.5 复合菌剂的制备及功能验证

2.5.1 拮抗试验及菌剂复配。

菌株间是否具有拮抗作用是实现菌株复配的前提，将不具有拮抗作用的菌株进行组合，才能使菌剂发挥最大效果。从拮抗试验结果（表6）可以看出，只有菌株P1和菌株A422间表现为轻微的拮抗作用，其余不存在拮抗关系，可利用这8株菌株进行复合菌剂构建，实现降解效果最大化。

取相同體积8株菌株的发酵液与灭菌麸皮以1∶1比例混合，发酵48 h后晾干，制成固体菌剂，并命名为Y8。

2.5.2 室内摇瓶试验。为检验所得复合菌剂Y8对玉米秸秆的实际降解效果，进行室内秸秆降解摇瓶试验。从图4可以看出，经40 d摇瓶培养后，添加复合菌剂Y8、市售菌剂农富康处理的秸秆降解率分别为44.70%、37.75%，而对照处理的秸秆降解率仅为28.25%，说明添加降解菌剂可提高秸秆的分解速率。同时，利用菌剂Y8进行处理的秸秆分解效果优于以市售菌剂进行处理的效果，此试验结果表明所研制的复合型菌剂降解能力强于市售菌剂，降解效果最为明显。

2.5.3 田间坑试。

室外的条件多变且充满不确定性，菌株能否正常定植生长、降解能力是否稳定，都是需要考虑的因素。从30 d后田间坑试结果（图5）可以看出，处理1为仅加入秸秆不做任何处理的样品，30 d后秸秆基本没有发生变化;处理2为只加入菌剂的样品，由于降雨等因素的影响，含水量相对充足，30 d后秸秆降解率达到50%;处理3为加入菌剂并用水和营养液混合处理的样品，30 d后土质疏松、含水量较足、玉米秸秆在复合菌剂及土著微生物的共同作用下降解率可达60%以上。上述结果表明，所研制的复合菌剂在人为干预下降解效果可进一步增强，即使无人为干预下仍可对秸秆的降解产生帮助。

3 讨论

研究表明，单一菌株制成的菌剂其降解玉米秸秆的效果并不理想[16-19]。因此，需要构建具有纤维素降解能力的多种菌株的组合，而筛选出合适的菌株是构建复合菌剂的关键。目前文献中提及的复合型菌系绝大多数以真菌为主，细菌、放线菌的应用较少[20]。该研究以玉米农田的土壤为菌种筛选来源，通过富集培养、刚果红染色等方式进行纤维素降解菌的初步筛选，测定多种纤维素酶活力确定高效降解菌株，通过抑菌性等试验丰富菌株功能，最终选择了8株细菌作为构建复合菌剂的菌种，并以拮抗试验为基础进行了复合菌剂的制作，通过室内摇瓶试验、田间坑试，综合评价复合菌剂的实际降解能力，为东北地区实现秸秆的高效处置提供微生物利用基础。

试验过程中进行了菌株对植物病原菌的抑菌性检测，发现所选用的8株菌株中菌株YD-1对玉米大斑病、玉米鞘腐病病原菌的生长表现为明显的抑制作用。当在PDA培养基中接入病原菌并培养7 d左右，病原菌菌丝可蔓延至平板1/2处，但当接入细菌，培养1～2 d后便可发生明显的抑制现象，表明所选用的菌株对底物的适应性较强，生长速度较快，符合实际生产所需。

4 结论

（1）以枯枝落叶覆盖较多的土壤、田间堆放玉米秸秆及种植玉米的土壤为筛选菌种来源，通过多重筛选试验，得到具有较强木质纤维素降解能力的8株细菌，分别为菌株D10-1、YD-1、50-15、BH5、A422、P3、P1、木13，经菌落和菌体形态观察及生理生化初步鉴定，这8株纤维素降解菌株均属于芽孢杆菌属（Bacillus sp.）。

（2）菌株D10-1、YD-1酶活力相对较高，分别可达2.547、2.673 U/mL;菌株YD-1对玉米大斑病、玉米鞘腐病病原菌的生长表现为明显的抑制作用;8株菌株彼此不存在明显拮抗作用，可将其复配成复合菌剂。

（3）菌剂Y8的秸秆降解功能验证：室内摇瓶试验40 d秸秆降解率为44.70%;田间坑试中菌剂Y8对秸秆的降解率可达60%以上。

参考文献

[1]

李金霞，何长安，王海玲，等.黑龙江省玉米产业发展现状及展望[J].农业展望，2020，16（1）：67-70.

[2] SUN M X，XU X B，WANG C D，et al.Environmental burdens of the comprehensive utilization of straw：Wheat straw utilization from a life cycle perspective[J].Journal of cleaner production，2020，259：1-12.

[3] 彭春艳，罗怀良，孔静.中国作物秸秆资源量估算与利用状况研究进展[J].中国农业资源与区划，2014，35（3）：14-20.

[4] 陈浩，李小刚，周游，等.农作物秸秆还田资源化利用研究进展[J].湖南农业科学，2015（6）：138-141.

[5] ZHUO F，ZHANG X F，LEI L L，et al.The effect of arbuscular mycorrhizal fungi and biochar on the growth and Cd/Pb accumulation in Zea mays[J].International journal of phytoremediation，2020，22（10）：1009-1018.

[6] 王洪媛，范丙全.三株高效秸秆纤维素降解真菌的筛选及其降解效果[J].微生物学报，2010，50（7）：870-875.

[7] 李文哲，朱巧银，范金霞，等.纤维素高效降解菌群构建及产酶底物优化[J].东北农业大学学报，2016，47（1）：81-86.

[8] 于素素.低温玉米秸秆降解菌的筛选及其复合菌系产酶条件优化[D].沈阳：沈阳农业大学，2019.

[9] 谭啸，章熙东.革兰氏染色法观察与区分细菌[J].生物学教学，2019，44（7）：71-72.

[10] 陈静，沈善瑞，赖晓芳，等.细菌芽孢染色方法的比較[J].科教文汇，2019（8）：69-70，75.

[11] 曹哲统，李映，尹一鸣，等.3-羟基丙酸发酵液絮凝-脱色工艺研究[J].北京化工大学学报（自然科学版），2017，44（1）：45-51.

[12] ZHANG H Y，DONG S R，LOU T T，et al.Complete genome sequence unveiled cellulose degradation enzymes and secondary metabolic potentials in Streptomyces sp.CC0208[J].Journal of basic microbiology，2018，59（3）：267-276.

[13] 尚婷婷，李全宏，邓尚贵.高效降解纤维素菌系的筛选分离及复合菌系的构建[J].中国农学通报，2014，30（31）：254-260.

[14] 李新.鞘腐病发生程度与玉米倒伏及产量损失间的相关性分析[J].农业开发与装备，2018（4）：102，105.

[15] RUSANEN A，LAPPALAINEN K，KRKKINEN J，et al.Selective hemicellulose hydrolysis of Scots pine sawdust[J].Biomass conversion and biorefinery，2019，9（2）：283-291.

[16] ZHENG G X，YIN T，LU Z X，et al.Degradation of rice straw at low temperature using a novel microbial consortium LTF 27 with efficient ability[J].Bioresource technology，2020，304：1-4.

[17] OLOWOMOFE T O，BABALOLA T F，OLUYIDE O O，et al.Isolation，screening and molecular identification of cellulose degrading bacteria from paper and pulp mill dumpsites[J].Frontiers in environmental microbiology，2019，5（3）：77-83.

[18] MARWA N，MISHRA N，SINGH N，et al.Effect of rhizospheric inoculation of isolated arsenic （As） tolerant strains on growth， As-uptake and bacterial communities in association with Adiantum capillus veneris[J].Ecotoxicology and environmental safety，2020，196：1-11.

[19] 宋德强，张雯婕，张玲，等.1株降解玉米秸秆放线菌的筛选[J].安徽农业科学，2016，44（9）：16-18.

[20] 宋云皓，满都拉，郜晋楠，等.玉米秸秆纤维素降解菌的筛选及复合菌系的构建[J].饲料工业，2017，38（19）：33-37.