宋明波 贺疆滔 谢春刚 蔡林钢 王松 刘延 时春明

摘    要：为了积极救护准噶尔雅罗鱼的种质资源，2019年首次在新疆精河入艾比湖三角洲开展准噶尔雅罗鱼标记放流，放流地点为艾比湖南岸湖滨区，标记方法有4种，分别是PIT频射芯片、色素注射、CWT线码和荧光（ARS）浸染标记，2019—2020年共标记3.2万尾。结果表明：准噶尔雅罗鱼PIT频射芯片标记伤口使用100 mg·L-1的高锰酸钾溶液涂抹消毒，有利于损伤组织迅速结痂，减少损伤处病原体感染;色素注射标记颜色以绿色为佳，植入鱼类上额的皮下组织，标记横向长度为10～12 mm;CWT线码标记的植入位置为上额的皮下组织;荧光浸染标记中茜素红S（ARS）浓度160～180 mg·L-1对准噶尔雅罗鱼未造成明显损伤;4种标记成活率均高于98.8%，标记保持率均高于93.7%，说明4种方法适合准噶尔雅罗鱼的放流标记。该结果可为准噶尔雅罗鱼的增殖放流及效果评估工作提供科研基础。

关键词：准噶尔雅罗鱼;标记放流;CWT线码标记;PIT频射芯片标记;色素注射标记;荧光（ARS）浸染标记

中图分类号：X835          文献标识码：A          DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2021.05.011

Abstract： In order to actively rescue the germplasm resources of Leuciscus merzbacheri， the experiment was conducted to release the labeled Leuciscus merzbacheri from JingheRiver to Ebinur Lake delta in Xinjiang firstly in 2019， and the releasing place was the lakeside area in the Southern Ebinur Lake. Four labeling methods including Passive integrated transponder（PIT）， pigment injection labeling， Coded Wire Tag（CWT） line code and fluorescence （Alizarin Red S， ARS） staining were used， and a total of 32 000 fish were labeled from 2019 to 2020.The results showed that 100 mg·L-1 potassium permanganate solution could be used in the fish wound formed in the PIT label method， which was conducive to the formation of injured tissue scab rapidly and the reduction of pathogen infection.The optimum color of pigment injection labeling method was green， the optimum injecting position was the subcutaneous tissue of the upper forehead，and the transverse length was 10-12 mm. The implantation position of CWT method was subcutaneous tissue of the upper forehead. The fluorescent staining showed that Alizarin Red S（ARS） concentration of 160-180 mg·L-1 did not cause obvious damage to the fish. The survival rate of the four markers was higher than 98.8%， and the retention rate was higher than 93.7%，indicating that all the four methods were suitable for the release marking of Leuciscus merzbacheri. This study could provide a scientific basis for the proliferation and release of Leuciscus merzbacheri and its effect evaluation.

Key words： Leuciscus merzbacheri; labeled release; Coded Wire Tag line code labeling; Passive integrated transponder; visible implant elastomer; fluorescence（Alizarin Red S， ARS）  staining labeling

標记放流技术最初用于研究鱼类的洄游，通常是给鱼做上标记后放流，再根据标志鱼的回捕记录，绘制该鱼的洄游路线图和回捕分布图，用以推测其游动的方向、路线、范围和速度;利用标志鱼类的回捕率以及体长、体重等生物学数据，可以估算标志鱼类种群的变动，评价增殖放流的效果[1]。近年来，由于标记方法和产品不断创新和完善，标记技术也随之获得很大发展[2]。鱼类标记技术大致分为 5 类：外部标记技术（External tag and mark）、内部标记技术（Internal tag and mark）、化学标记技术（Chemical mark）、生物标记技术（Biological mark）及分子标记技术（Genetic mark）[3]。其中，常用的标记方法包括：PIT频射芯片标记（PIT，Passive integrated transponder）、CWT线码标记（CWT，Coded Wire Tag）、色素注射标记（VIE，Visible implant elastomer） 、茜素红S（ARS ，Alizarin red S）荧光浸染标记等，前二者均属物理标记，后二者属于化学标记。PIT频射芯片标记即将规格为8 mm×1.4 mm的玻璃材质芯片，采用皮植方法注射于鱼体背鳍下端的肌肉里进行标记，每个芯片有独自编码，使用手持扫码器即可检出;CWT线码标记也称十进制编码鱼类标记线，是通过特定的标志器将有标编码的细小金属丝注入鱼体的一种体内标志，此方法保留时间较长，手持金属探测器可检出，方便回捕跟踪调查研究鱼类生活习性;色素注射标记即用鱼类荧光标记与鱼类荧光标记催化剂混合后，在6～24 h内将标记注入鱼体皮下，标记后鱼体肉眼可清晰辨别色素带，主要应用于种群区分，封闭流域，保护物种放流;茜素红S是一种染料型配位剂，可与钙离子配合以沉淀沉积在骨骼中形成荧光标记[4]。

对于濒危物种而言，大规模人工放流之后，对其进行标记回捕可以建立数据库，进行数学模型分析，定期监测野生种群动态变化，评估人工放流的成效等[5]。与新疆裸重唇鱼（Gymnodiptychus dybowskii）共同列为I级保护水生野生动物[6]的准噶尔雅罗鱼（Leuciscus merzbacheri）属鲤科雅罗鱼属，为冷温带平原区的上层鱼类，该鱼为河湖型的小型鱼类，体长形，侧扁，腹部圆，体长和体质量分别可达31 cm和403 g，属杂食性鱼类，主要以有机碎屑、水生植物和水生昆虫为食，其在精河天然水域中性腺发育到Ⅳ期的时间为4～6月，成熟卵粒为淡黄色。准噶尔雅罗鱼在世界范围仅分布于中国新疆北部的准噶尔盆地（45°N，85°E），是该区域内标志性物种，也是新疆独有的土著鱼类，为准噶尔盆地诸河中唯一一种具有较高经济价值的鱼类[6-7];其早期自然分布的水域包括玛纳斯河、奎屯河、精河、博尔塔拉河等;由于水生生态环境的变化，以及人类的经济活动，准噶尔雅罗鱼生存的天然河道渠系化、水量减少、鱼类栖息生境破碎化和生态阻隔，造成了准噶尔雅罗鱼分布范围不断萎缩，目前仅在精河入艾比湖三角洲、奎屯河入艾比湖河口区域内有分布;1998年准噶尔雅罗鱼被《中国濒危动物红皮书》（鱼类）列为易危物种[8]。

近年来，由于人类活动、自然生境改变以及水质下降等因素的影响，新疆渔业资源量明显降低，土著鱼类增殖放流作为恢复和改善渔业资源量的一项主要措施在新疆已执行多年[9]。2018年，新疆已开展额尔齐斯河、伊利河和塔里木河水系3种代表性土著鱼种──扁吻鱼（Aspiorhynchus laticeps）、高体雅罗鱼（Leuciscus idus）和新疆裸重唇鱼（Gymnodiptychus dybowskii）标记放流[9]，但尚未开展准噶尔雅罗鱼增殖放流标记工作，因此开展新疆准噶尔雅罗鱼的增殖放流以及效果评估，对准噶尔雅罗鱼种群的恢复和改善意义重大。

本研究对准噶尔雅罗鱼增殖放流苗种开展标记工作，筛选有利于大规模标记放流的适用性好、稳定性高、识别性强、操作简单的标记方法，旨在为了解准噶尔雅罗鱼种群的动态变化规律并掌握其放流效果提供技术支撑。

1 材料和方法

1.1 试验鱼

试验用准噶尔雅罗鱼由新疆水生野生动物救护中心自繁提供，均为子一代培育种，共2种规格，其中0+龄子一代鱼种平均体质量（12.82±4.66） g，平均体长（10.16±0.86） cm;1+龄子一代鱼种体质量（63.75±10.22） g，体长（15.14±0.94） cm。

1.2 试验方法

1.2.1 试验鱼暂养 标记前的鱼种均在PE桶（150 cm×150 cm×100 cm）内进行暂养5～7 d，标记前1 d停止投喂。

1.2.2 试验鱼标记 标记所用器材及标记物于标记前均浸于75%酒精中消毒。2种规格的试验鱼在标记过程中均使用浓度为700～800 μL·L-1的2-苯氧乙醇进行麻醉，使试验鱼在3～5 min内进入麻醉状态，上下唇能够微微张合，鱼体基本无摆动，麻醉的效用在于减少鱼体应激状态，标记完成后放入清水中，2～3 min即可恢复游动。鱼体标记完成后需使用适宜药剂进行涂抹消毒。

试验于2019—2020年采用PIT频射芯片标记、色素注射标记、CWT线码标记、荧光浸染标记4种方法对准噶尔雅罗鱼进行标记。

（1）PIT频射芯片标记采用美国NMT公司提供的电子芯片，对准噶尔雅罗鱼1+龄子一代鱼种标记1 000尾，标记规格平均体长（15.14±0.94） cm，标记部位为背鳍下侧，横向进针深度10～15 mm，按照消毒和注射程序每尾标记电子芯片1个，芯片编码区间为900219000018661～900219000019660（图1-A）。标记后的伤口杀菌消毒药剂设高锰酸钾、红霉素软膏和聚维酮碘溶液等3种开展对比试验，每组100尾标记鱼，设2个平行组，按照药物对准噶尔雅罗鱼的杀菌效果和成活率筛选适宜的杀菌消毒药剂。

（2）色素注射标记采用魚类荧光标记（VIF，青岛海星仪器有限公司）与鱼类荧光标记催化剂（青岛海星仪器有限公司）混合后，设置绿色和蓝色2种颜色，均以0.01～0.02 mL的注射体积对准噶尔雅罗鱼进行色素注射标记（图1-B），同时设上额的皮下组织、眼眶后缘的角质层和鳃盖膜下缘的角质层3个标记部位开展对比试验，每组标记100尾试验鱼，设置2个平行组，根据色素带注射判断标准判断不同部位的注射效果，以筛选出最适色素颜色和最佳注射部位。色素带判断标准[9]：Ⅰ.水体中及渔获中清晰辨别色素带;Ⅱ.可辨别，但鱼体体色转换逐渐影响色素带判断;Ⅲ.无法判断，不能辨别鱼体色素带，标记无效。

（3）使用美国NMT公司提供的CWT线码标记枪与线码对准噶尔雅罗鱼进行标记，植入位置为上额的皮下组织（图1-C），标记枪进针深度10～12 mm，0+龄准噶尔雅罗鱼子一代鱼种标记1 000尾，标记规格平均体长（10.16±0.86） cm，每段标记线编码相同，编码均为271471（图1-D） ，表示同一批次增殖放流鱼种。

（4）选取Sigma牌茜素红S钠盐（上海安谱实验科技股份有限公司）作为标物，选用浓度为160～180 mg·L-1，浸染24～36 h，对试验鱼进行荧光浸染标记，标记后可在上下颌（图1-E）、耳石、鳍条、鳃盖和鳞片等骨质结构上形成相应标记环。

统计上述4种方法标记的死亡率、保持率等数据，以筛选适宜准噶尔鱼的最适标记方法。标记死亡率以标记完成后，在增殖放流时进行统计，以死亡个体百分比计。复测方法：标记完成后的试验鱼暂养7～10 d，根据标记数量随机取 5%～10%个体复测标记，保持率以可复测个体百分比计。所有类型标记鱼种放流前均于水生野生动物救护中心留存200尾，在经过150 d的暂养留存后，用于标记留存时效的后期观察。

1.3 放流

将已标记过的准噶尔雅罗鱼的试验鱼，通过液态氧气罐车运输至精河入艾比湖三角洲的南岸湖滨区。该水域水深为2.0～3.5 m，水质清澈，水草丰富，适合其试验鱼的索饵、越冬和洄游，为优质的放流栖息地。

1.4 数据统计分析

试验数据用平均值±标准差（Mean±SD）表示。

2 结果与分析

2.1 不同杀菌药物对PIT频射芯片标记伤口的影响

PIT频射芯片标记受到其个体大小、肌肉损伤程度和药物治疗效果的影响，而出现不同的死亡情况。在采取相同的肌肉注射和个体大小的条件下，高锰酸钾溶液成活率大于99.5%（表1），因此选择100 mg·L-1的高锰酸钾溶液对植入的损伤部位进行涂抹，更有利于损伤组织迅速结痂，减少损伤处病原体感染（图1-F）。

2.2 色素注射颜色与标记部位的筛选

色素注射标记不同位置与颜色的效果对比表明（表2），准噶尔雅罗鱼上额的皮下组织标记长度最长、损失率最低，且该标记部位的绿色色素带长度和辨识度均优于蓝色，说明色素注射标记对准噶尔雅罗鱼来说宜选择绿色，且注射在上额的皮下组织效果较好。

2.3 标记保持率和死亡率

在标记保持率方面，CWT线码和PIT频射芯片标记保持率均在99.5%以上（表3），植入位置分别为上额的皮下组织和背鳍下侧肌肉内，效果显著。色素注射标记保持率最低值93.7%，并随着时间的延长，会出现一定的丢失现象。在标记死亡率方面，PIT频射芯片标记死亡率小于1.2%（表3），荧光（ARS）浸染、CWT线码和色素注射标记死亡率均小于0.1%。

3 结论与讨论

2019—2020年新疆水产科研所采取4种方法，共标记准噶尔雅罗鱼3.2万尾，陆续向艾比湖南岸湖滨区开展增殖放流活动，成活率均高于98.8%，标记检出率高于93.7%。通过研究不同的侧重点，如PIT频射芯片标记侧重于大规格亲鱼的跟踪;CWT线码、荧光（ARS）浸染和色素注射标记适合大规模的同批次鉴定标记，也各有不同的优点，增殖放流和效果评价时可根据需求选取上述对应的标记方法，进而研究其种群动态参数，包括种群年龄组成、成活率、死亡率、性别比例、资源量、迁移率、食性等。这对合理使用资源，保护准噶尔雅罗鱼等易危物种具有重要意义。

3.1 PIT频射芯片标记

PIT频射芯片标记是近年来迅速发展的电子生物标记技术，在野生和养殖鱼类以及其他动物研究中取得广泛成功，该技术准确率高，可以让每一个被标记动物个体有1个唯一的身份证，有助于对有价值的物种进行跟踪监测[10]。PTT标记以其能够跟踪到个体水平、持久性、试验鱼类感染率低、早期标记、标记重读率高，目前已经应用到露斯塔野鲮（Labeo rohita）、大口鲈（Micropterus salmoides）、鲤（Cyprinidae）和罗非鱼（Oreochromis niloticus）等鱼类选育工作中[11]。准噶尔雅罗鱼PIT标记最佳位置为背鳍下侧肌肉内，横向进针深度10～15 mm。黄松林等[12]研究表明，PIT标记也有局限性，某些体型过小的物种或者亚成体并不具备植入PIT标签的条件。因此，本研究选择体长13.6 mm以上的1+龄及以上鱼种进行标记，保持率可达99.7%。PIT标记是体内注射标记，稳定性较好，保留率较高，这与郝雅宾等[13]研究结果相似，但有的个体扫描未有结果，且解剖未发现PIT标记，可能是注入结束后，拔出注射器时将其顺带而出的原因造成的。准噶尔雅罗鱼在进行PIT标记时，要将100 mg·L-1较高浓度的高锰酸钾溶液涂抹创伤消毒，以减少损伤处病原体感染，待损伤组织快速结痂以后再进行放流。

3.2 色素注射标记

色素注射标记（VIE）是用注射器在水生动物的透明或半透明的外表皮注入可识别的荧光胶体，形成可识别的外部标志荧光。本试验中，用注射器将鱼类标志专用的绿色、蓝色荧光色素注射到准噶尔雅罗鱼上额、眼眶后缘和鳃盖膜下缘，标记长度为 5.4～14.6 mm，可利用紫外灯照射方法来鉴定鱼苗是否具有荧光标记;标记用的绿色和蓝色染料按说明书进行配制，染料与凝固剂按10∶1的比例混合均匀[14]，在经过150 d的暂养留存后，准噶尔雅罗鱼色素注射标记的标记物会出现部分损失或全部丢失的情况，鳃盖膜下缘色素带损失率为10.8%，上额与眼眶后缘留存较好，色素带损失率为1.3%和2.7%。Simon等[15]采用VIE标记小鳗鲡（Anguilla anguilla） 的32 d标记保持率为100%，但512 d的标记保持率66%，说明VIE较适宜于短期标记，标记物保持率可能与其标记物浓度配比、标记物凝结时间和标记位置等相关。

3.3 CWT线码标记

CWT线码标记是一种广泛使用的标记方法，主要利用标记枪将金属线码切割下来，植入鱼体上额的皮下组织或背部肌肉内，回捕鱼类后，手持金属探测器找准部位检测线码并取出，在显微镜下将其讀取编码，以编码对应指定的放流年限和批次。CWT线码标记对标记对象的生长、存活以及行为影响较小，非常适于标记个体很小的鱼类，0.5 mm长的标能成功用于体质量仅0.25 g的细鳞大马哈鱼（Oncorhynchus tshawytscha），标志保持率一般较高[16]。标记保持率是衡量放流标记是否适宜鱼苗标记的重要指标之一[17]，准噶尔雅罗鱼150 d后的保持率同样达到99.5%，死亡率为0，且易于辨识。CWT 标记小鳗鲡512 d的标记保持率为99%，CWT适合长期标记。在为期91 d的拉萨裸裂尻鱼（Schizopygopsis younghusbandi）标志筛选试验中，CWT标记未对拉萨裸鲤尻鱼幼鱼的生长和存活造成显著性影响，同时标记的保持率也都保持在99%以上[18]，说明CWT标记是适合的标记方式。

3.4 荧光（ARS）浸染标记

荧光药物（茜素红S）浸泡法，是一种操作简单、对鱼体伤害小的标记方法，但过高浓度引起致死率高[19]。欧阳斌和常剑波[20]在荧光物质浸泡标记稀有鲫鮈（Gobiocypris rarus）仔、稚鱼的研究中发现茜素络合物在浓度为30～150 mg·L-1（浸泡 24 h）时稀有鲫鮈幼鱼成活率大多达到100%，在浓度为200 mg·L-1时，死亡率为100%;张涛等[19]在保证存活率的基础上，扁吻鱼选用179～400 mg·L-1做标记。通过本试验初步认为，浓度160～180 mg·L-1对准噶尔雅罗鱼未造成明显损伤，标记效果较好。ARS可在黑鲷（Acanthopagrus schlegelii）钙化组织上形成清晰、肉眼可见的紫色或紫红色的标记，此研究结果与刘岩等[21]、王臣等[22]研究的结果向一致。为掌握准噶尔雅罗鱼对茜素红S的毒性反应，需要进一步开展急性毒性试验。

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